0.3解决方案
0.3.1答案1:加载数据
Bioconductor软件包通常定义并为其数据对象使用自定义类，这确保了所有所需的数据插槽都是一致的，并满足要求。
存储在里面的数据气道是一个SummarizedExperiment对象。
图书馆（“气道”）数据（Airway）SE < - Airway Se## class: rangedsummarizeexperiments ## dim: 64102 8 ## metadata(1): " ## assays(1): counts ## rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005…LRG_98 LRG_99 ## rowRanges元数据列名称(0):## colnames(8): SRR1039508 SRR1039509…SRR1039520 SRR1039521 ## colData names(9): SampleName cell…样本BioSample对于一个SummarizedExperiment对象,分析(s)包含汇总值的矩阵(或矩阵)Rowdata.包含关于基因组范围的信息，和colData包含有关样品或实验的信息。
(试验(se))# # SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 # # ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 1047 770 # # ENSG00000000005 0 0 0 0 0 0 0 # # ENSG00000000419 467 515 621 365 587 799 417 # # ENSG00000000457 260 211 263 164 245 331 233 55 # # ENSG00000000460 60 40 35 78 63 76 # # ENSG00000000938 0 0 2 0 1 0 0 # # SRR1039521 # #ENSG00000000003 572 ## ENSG00000000005 0 ## ENSG00000000419 508 ## ENSG00000000457 229 ## ENSG00000000460 60 ## ENSG00000000938 0COLSUMS（测定（SE））## SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 SRR1039521 ## 20637971 18809481 25348649 15163415 24448408 30818215 19126151 21164133colData (se)## Dataframe带8行和9列## Samplename Cell Dex Albut Run Avglength实验样本## <因子> <因子> <因子> <因子> <因子> <整数> <因子> <因子> ## SRR1039508 GSM1275862 N61311untrt untrt SRR1039508 126 SRX384345 SRS508568 ## SRR1039509 GSM1275863 N61311 TRT untrt SRR1039509 126 SRX384346 SRS508567 ## SRR1039512 GSM1275866 N052611 untrt untrt SRR1039512 126 SRX384349 SRS508571 ## SRR1039513 GSM1275867 N052611 TRT untrt SRR1039513 87 SRX384350 SRS508572 ## SRR1039516 GSM1275870 N080611 untrt untrt SRR1039516 120 SRX384353 SRS508575## SRR1039517 GSM1275871 N080611 TRT untrt SRR1039517 126 SRX384354 SRS508576 ## SRR1039520 GSM1275874 N061011 untrt untrt SRR1039520 101 SRX384357 SRS508579 ## SRR1039521 GSM1275875 N061011 TRT untrt SRR1039521 98 SRX384358 SRS508580 ##生物样品## <因数> ## SRR1039508 SAMN02422669 ## SRR1039509 SAMN02422675＃#srr1039512 samn02422678 ## SRR1039513 SAMN02422670 ## SRR1039516 SAMN02422682 ## SRR1039517 SAMN02422673 ## SRR1039520 SAMN02422683 ## SRR1039521 SAMN02422677rowRanges (se)## GRangesList对象长度64102:## $ENSG00000000003 ## GRangesList对象17范围和2元数据列:# # seqnames范围链| exon_id exon_name # # < Rle > < IRanges > < Rle > | <整数> <人物> # # [1]X(99883667、99883667)- 667145 | ENSE00001459322 # # [2] X(99885756、99885756)- | 667146 ENSE00000868868 # # [3] X(99887482、99887482)- | 667147 ENSE00000401072 # # [4] X(99887538、99887538)- | 667148 ENSE00001849132 # # [5] X [99888402,99888536) - | 667149 ENSE00003554016 ## ... ... ... ... ... ... ...# # [13] X(99890555、99890555)- 667156 | ENSE00003512331 # # [14] X(99891188、99891188)- | 667158 ENSE00001886883 # # [15] X(99891605、99891605)- | 667159 ENSE00001855382 # # [16] X(99891790、99891790)- | 667160 ENSE00001863395 # # [17] X(99894942、99894942)- | 667161 ENSE00001828996 ## ## ...## <64101 more elements> ## ------- ## seqinfo: 722个序列(1个循环)来自一个未指定的基因组在deseq2.，调用自定义类deseqdataset.。它建立在顶部SummarizedExperiment类。
图书馆（DESEQ2）##加载所需包：RCPP ##加载所需包：RCPParmadilloDDS < - DESQDATASET（SE，DESIGN =〜CELL + DEX）0.3.2答案2:rlog变换
许多用于多维数据探索性分析的常用统计方法，特别是聚类和排序方法(如主成分分析等)，最适合于(至少近似地)同方差数据;这意味着一个观测量的方差(这里是一个基因的表达强度)不依赖于平均值。
在RNA-Seq数据中，方差随均值增长。如果对一个归一化读计数矩阵进行PCA(主成分分析)，其结果通常只取决于少数表达最强烈的基因，因为它们显示了样本之间最大的绝对差异。
作为解决方案，DESEQ2提供了正规化对数转换，或简短的RLOG。有关更多信息和选项，请参阅帮助？RLOG。
函数rlog返回一个summarizedexperimental对象，该对象在其分析槽中包含rlog转换后的值:
RLD < - RLOG（DDS）头（测定（RLD））## SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 ## ENSG00000000003 9.399151 9.142478 9.501695 9.320796 9.757212 9.512183 9.617378 ## ENSG00000000005 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 0.000000 ## ENSG00000000419 8.901283 9.113976 9.032567 9.063925 8.981930 9.108531 8.894830 ## ENSG000000004577.949897 7.882371 7.834273 7.916459 7.886645 7.946411 ## ENSG00000000460 5.849521 5.882363 5.486937 5.770334 5.940407 5.663847 6.107733 ## ENSG00000000938 -1.638084 -1.637483 -1.558248 -1.636072 -1.597606 -1.639362 -1.637608 ## SRR1039521 ## ENSG00000000003 9.315309 ## ENSG00000000419 9.052303 ## ENSG000000004577.908338 ## ENSG00000000460 5.907824 ## ENSG00000000938 -1.6377240.3.3答案3:可视化数据
评估样本之间的整体相似性:哪些样本彼此相似，哪些不同?这符合实验设计的预期吗?我们使用R函数dist来计算样本之间的欧氏距离。为了避免距离测量是由几个高度可变的基因主导的，并且有来自所有基因的大致相同的贡献，我们在rlog转换的数据上使用它
抽样检验员<- dist(t(分析(rld)))抽样检验员## SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 SRR1039517 SRR1039520 37.35231 50.07638 ## SRR1039516 41.49280 43.61052 ## SRR1039516 41.98797 53.58929 40.99513 57.10447 ## SRR1039517 37.06633 51.80994 34.86653 52.54968 43.2178657.13688 ## SRR1039521 56.04254 41.46514 51.90045 34.82975 58.40428 47.90244 44.78171注意使用函数t来转置数据矩阵。我们需要这样做，因为dist计算数据行之间的距离，我们的样本构成列。
0.3.3.1.的热图
我们使用heatmap函数在热图中可视化样本到样本的距离。2来自gplot包。注意，我们更改了距离矩阵的行名，使之包含治疗类型和患者编号，而不是样本ID，这样在查看热图时就可以看到所有这些信息。
图书馆（“GPLOTS”）库（“RCHRORBREWER”）SAMPLEDISTMATRIX < - AS.MATRIX（SAMPLEDISTER）Rownames（SAMPLEDISTMATRIX）< - PERTE（RLD $ DEX，RLD $ CELL，SEP =“ - ”）颜色< - 托罗拉水壶（REV（Brewer.pal（9，“蓝调”））））（255）HC < - HCLUST（SAMPLEDISTER）HEATMAP.2（SAMPLEDISTMATRIX，ROWV = AS.DENDORGRAM（HC），SYMM = TRUE，TRACE =“无”，COL =颜色，MARGINS = C（2,10），Labcol = false）
0.3.3.2.主成分分析
可视化样本到样本距离的另一种方法是主组件分析（PCA）。在这种顺序方法中，数据点（即，这里，样本）被投影到2D平面上，使得它们在两个方向上展开，该方向解释数据的大多数差异。X轴是将数据点最多的方向（或主成分）。沿轴标签印刷在方向上的总方差的量。在这里，我们使用了Deseq2的功能Plotpca。IntGroup指定的两个术语是标记样本的有趣组;他们讲述功能使用它们选择颜色。
plotPCA(rld, intgroup = c("dex"， "cell"))
0.3.3.3.MDS
另一个图，非常类似于PCA图，可以使用基r中的多维尺度(MDS)函数来制作。当我们没有原始数据，只有距离矩阵时，这是有用的。这里我们有从rlog转换计数计算出的距离的MDS图:
库（GGPlot2）MDS < - data.frame（cmdscale（sampledistmatrix））mds < - cbind（mds，coldata（rld））qplot（x1，x2，color = dex，shape = cell，data = as.data.frame（MDS）））
0.3.4答案四:总结一下情节
我们看到细胞之间的差异是相当大的，尽管与用地塞米松治疗引起的差异不强。这表明通过使用配对的设计（'配对'在差分测试中解释这一点是重要的，因为每个DEX处理的样品与来自同一细胞系的一个未处理的样品配对）。我们已经通过在开头设置数据对象时使用设计公式〜Cell + DEX来设置。