1．1概述

最小的输入弹弓表示降维空间中的单元格的矩阵和簇标签的向量。有了这两个输入，我们:

• 通过在集群上构造最小生成树(MST)来识别全局谱系结构getLineages函数。
• 构造平滑谱系和推断伪时间变量通过拟合同时主曲线与getCurves函数。
• 使用内置的可视化工具评估每个步骤的输出。

1．2数据集

在这个小插图中，我们将使用两个模拟数据集。第一个数据集(称为“单轨迹”数据集)生成于下面，旨在表示一个单一谱系，其中三分之一的基因与过渡相关。该数据集将包含在SingleCellExperiment对象(Lun and Risso 2017)并将用于演示一个完整的“从开始到结束”工作流。

#生成合成计数数据代表一个血统意味着< - rbind (# non-DE基因矩阵(代表(代表(c(0.1, 0.5, 1、2、3),每个= 300),100),ncol = 300, byrow = TRUE), #早期失活矩阵(代表(exp(每股(((300:1)-200)/ 50)),50),ncol = 300, byrow = TRUE), #晚期失活矩阵(代表(exp(每股(((300:1)-100)/ 50)),50),ncol = 300, byrow = TRUE), #早期激活矩阵(代表(exp(每股(((施用)-100)/ 50)),50),ncol = 300, byrow = TRUE),#延迟激活矩阵(rep(exp(atan((1:300)-200)/50)，50)， ncol = 300, byrow = TRUE)， #瞬态矩阵(rep(exp(atan(c((1:100)/33, rep(3100)， (100:1)/33))，50)， ncol = 300, byrow = TRUE)) counts <- apply(means,2,function(cell_means){total <- rnbinom(1, mu = 7500, size = 4) r多项(1,total, cell_means)}) rownames(counts) <- paste0('G'， 1:50 50) colnames(counts) <- paste0('c'，1:300) sce <- singlecel实验(assays = List(counts = counts))

第二个数据集(“分岔”数据集)包括一个坐标矩阵(就像通过PCA、ICA、扩散映射等获得的一样)以及由\ (k \)——集群。这个数据集代表了一个分叉的轨迹，它将允许我们演示一些额外的功能弹弓。

library(slingshot, quiet = FALSE) data("slingshotExample") rd <- slingshotExample$rd cl <- slingshotExample$cl dim(rd) #表示降维空间中的单元格的数据

## [1] 140 2

长度(cl) #簇标签向量

140

2.1基因的筛选

要开始分析单一谱系数据集，我们需要降低数据的维数，过滤掉无信息的基因是典型的第一步。这将大大提高下游分析的速度，同时将信息损失降至最低。

对于基因过滤步骤，我们保留了在至少足够多的细胞中稳健表达的任何基因，以构成一个集群，使它们成为潜在的有趣的细胞类型标记基因。我们将这个最小簇大小设置为10个细胞，并将一个基因定义为“稳健表达”，如果它具有至少3个reads的模拟计数。

#过滤基因到潜在的细胞类型标记#至少M(15)读取至少N(15)个细胞geneFilter <- apply(assays(sce)$counts,1,function(x){sum(x >= 3) >= 10}) sce <- sce[geneFilter，]

2．2归一化

在大多数RNA-Seq分析管道中另一个重要的早期步骤是标准化方法的选择。这使我们能够从数据中去除不需要的技术或生物伪影，如批处理、测序深度、细胞周期效应等。在实践中，比较各种归一化技术并按照不同的评估标准进行比较是有价值的，为此我们推荐司康饼包(Cole and Risso 2018)。我们还注意到，这些步骤的顺序可能会根据方法的选择而改变。ZINB-WaVE(Risso et al. 2018)在考虑技术变量和MNN的同时进行维数降低(Haghverdi et al. 2018)修正了降维后的批量效果。

由于我们使用的是模拟数据，所以不需要担心批量效应或其他潜在的混杂因素。因此，我们将继续进行完全分位数归一化，这是一种完善的方法，它迫使每个细胞具有相同的表达值分布。

FQnorm <- function(counts){rk <- apply(counts,2,rank,ties.method='min')计数。年代或t <- apply(counts,2,sort) refdist <- apply(counts.sort,1,median) norm <- apply(rk,2,function(r){ refdist[r] }) rownames(norm) <- rownames(counts) return(norm) } assays(sce)$norm <- FQnorm(assays(sce)$counts)

2．3降维

的基本假设弹弓转录相似的细胞会在某个降维空间中彼此靠近。由于我们使用欧几里得距离来构建谱系和测量伪时间，因此对数据进行低维表示非常重要。

有许多方法可用于此任务，我们将有意避免确定哪个是“最佳”方法的问题，因为这可能取决于数据类型、收集方法、上游计算选择和许多其他因素。我们将演示两种降维方法:主成分分析(PCA)和统一流形近似和投影(UMAP)，通过uwot包)。

在进行主成分分析时，我们不根据基因的方差对基因进行缩放，因为我们不相信所有的基因都具有相同的信息量。我们想要在稳定表达的，高度可变的基因中找到信号，而不是通过在基因中强制相同的方差来抑制这个信号。在绘图时，我们确保设置长宽比，以免扭曲感知的距离。

Pca <- prcomp(t(log1p(assays(sce)$norm))，量表。= FALSE) rd1 < - pca $ x[1:2]阴谋(rd1坳= rgb(0, 0, 0, 0。5)pch = 16, asp = 1)

库(uwot)

##加载所需的包:矩阵

## ##附件:《黑客帝国》

下面的对象从“package:S4Vectors”中屏蔽:## ## expand

rd2 <- uwot::umap(t(log1p(assays(sce)$norm)) colnames(rd2) <- c('UMAP1'， 'UMAP2') plot(rd2, col = rgb(0,0,0，.5)， pch=16, asp =1)

我们将把这两种降维都加到SingleCellExperiment对象，但继续我们的分析集中在PCA结果。

reducedDims(sce) <- SimpleList(PCA = rd1, UMAP = rd2)

2.4聚类细胞

最终的输入弹弓是单元格的群集标签向量。如果没有提供，弹弓将数据视为单个簇并拟合标准主曲线。然而，我们建议即使在只有单一谱系的数据集中也要对细胞进行聚类，因为这样可以潜在地发现新的分支事件。

在此步骤中确定的集群将用于确定底层谱系的全局结构(即它们的数量，它们何时从另一个分支，以及这些分支事件的大致位置)。这与聚类单细胞数据的典型目标不同，后者是识别数据集中存在的所有生物学相关的细胞类型。例如，在确定全局谱系结构时，不需要区分未成熟和成熟神经元，因为两种细胞类型大概都属于谱系的同一段。

对于我们的分析，我们实现了两种聚类方法，它们同样假设低维空间中的欧几里得距离反映细胞之间的生物学差异:高斯混合建模和\ (k \)则。前者是在mclust包(scucca et al. 2016)并具有基于贝叶斯信息准则(BIC)确定聚类数量的自动化方法。

library(mclust, quiet = TRUE)

##“mclust”软件包5.4.10版本##输入“citation(“mclust”)”用于在出版物中引用此R软件包。

## ##附加包:“mclust”

以下对象从“package:mgcv”中屏蔽:## ## mvn

cl1 <- Mclust(rd1)$classification colData(sce)$GMM <- cl1 library(RColorBrewer) plot(rd1, col = brewer.pal(9，"Set1")[cl1]， pch=16, asp =1)

而\ (k \)-means没有类似的功能，我们已经在(Street et al. 2017)同时主曲线的鲁棒性很强\ (k \)，所以我们选择a\ (k \)任意的4个。如果这个值太低，我们可能会错过一个真正的分支事件，如果它太高或有大量的小簇，我们可能会开始看到虚假的分支事件。

cl2 <- kmeans(rd1, centers = 4)$cluster colData(sce)$kmeans <- cl2 plot(rd1, col = brew .pal(9，"Set1")[cl2]， pch=16, asp =1)

4．1识别时间动态基因

在运行弹弓在美国，我们经常对寻找在发育过程中改变表达的基因感兴趣。，我们将演示这种类型的分析tradeSeq包(Van den Berge et al. 2020)。

对于每个基因，我们将使用负二项噪声分布拟合一个通用加性模型(GAM)来模拟基因表达和伪时间之间(潜在的非线性)关系。然后，我们将测试表达式和伪时间之间的显著关联associationTest。

库(tradeSeq) #适合负二项式GAM sce <- fitGAM(sce) #测试动态表达式ATres <- associationTest(sce)

然后，我们可以根据p值挑选出最重要的基因，并用热图将它们在发育过程中的表达可视化。这里我们使用了前250个最动态表达的基因。

topgenes <- rownames(ATres[order(ATres$pvalue)，])[1:250] pst。ord <- order(sce$slingPseudotime_1, na。last = NA)热数据<- assays(sce)$counts[topgenes, pst.]heatclus <- sce$GMM[pst.]奥德] heatmap(log1p(heatdata), Colv = NA, ColSideColors = brewer.pal(9,"Set1")[heatclus])

5.1确定全球谱系结构

的getLineages函数以an作为输入n\ \(\倍)p矩阵和向量的聚类结果的长度n。它使用最小生成树(MST)映射相邻集群之间的连接，并通过这些表示谱系的连接标识路径。这个函数的输出是aPseudotimeOrdering包含输入以及推断的MST(由igraph对象)和谱系(集群名称的有序向量)。

这种分析可以以完全无监督的方式进行，也可以通过指定已知的起始点和终点集群以半监督的方式进行。如果我们不指定起点，弹弓基于简约性选择一个，在分裂之前最大化谱系之间共享的集群数量。如果没有分割或多个集群产生相同的简约分数，则任意选择起始集群。

在我们的模拟数据中，弹弓选择集群1作为起始集群。然而，我们通常建议基于先验知识(样本收集时间或已建立的基因标记)来指定初始聚类。该规范对如何构造MST没有影响，但它将影响如何构造分支曲线。

lin1 <- getLineages(rd, cl, start. lin1)Clus = '1') lin1

##类:pseudotimeorders ## dim: 140 2 ##元数据(3):lineages mst slingParams ## pathStats(2):伪时间权重## cellnames(140): cell-1 cell-2…cell-139 cell-140 ## cellData names(2): reducedDim clusterLabels ## pathnames(2): Lineage1 Lineage2 ## pathData names(0):

plot(rd, col = brewery .pal(9，"Set1")[cl]， asp = 1, pch = 16) lines(SlingshotDataSet(lin1)， lwd = 3, col = 'black')

在这一步，弹弓还允许指定已知端点。当MST构建时，指定为终端单元状态的集群将被限制为只有一个连接。，则为叶节点)。这个约束可能会影响树的其他部分的绘制方式，如在下一个示例中所示，我们将Cluster 3指定为端点。

lin2 <- getLineages(rd, cl, start. lin2)Clus = '1'，结束。clus = '3') plot(rd, col = brewery .pal(9，"Set1")[cl]， asp = 1, pch = 16) line (SlingshotDataSet(lin2)， lwd = 3, col = 'black'， show。约束= TRUE)

这种类型的监督对于确保结果与先前的生物学知识一致是有用的。具体来说，它可以防止已知的终端细胞命运被归类为短暂状态。

还有一些我们可以传递的附加参数getLineages为了更好的控制:

• dist.method指定如何计算群集之间距离的字符。默认值为“弹弓”，它使用聚类中心之间的距离，由它们的完整联合协方差矩阵归一化。在存在小簇的情况下(单元格少于数据的维数)，这将自动切换到使用对角联合协方差矩阵。其他选项包括简单的(欧氏),scaled.full，scaled.diag,的内容(相互最近邻的距离)。
• ω粒度参数，允许用户设置连接距离的上限。它表示每个真实的星团和人工星团之间的距离.OMEGA集群，在装配MST后被移除。这对于识别不属于任何谱系的异常群集或分离不同的轨迹非常有用。这可能是一个数字参数或逻辑值。值为真正的表示的启发式\ \ (1.5)(无监督MST的中值边长)应该用，暗示最大允许距离会是多少3 \ \ ()乘以这个距离。

构造MST后，getLineages在树中标识要指定为谱系的路径。在此阶段，沿袭将由一组有序的集群名称组成，从根集群开始，以叶集群结束。的输出getLineages是一个PseudotimeOrdering它保存了所有的输入以及谱系的列表以及关于它们如何构造的一些附加信息。对象的输入getCurves函数。

5.2构建平滑曲线和排序单元格

为了模拟沿着这些不同谱系的发展，我们将用函数构造平滑曲线getCurves。使用基于所有单元格的平滑曲线消除了单元格投影到分段线性轨迹顶点的问题，并使弹弓聚类结果对噪声有较强的鲁棒性。

为了建立平稳的血统，getCurves遵循一个迭代过程，类似于主要曲线提出的(哈斯蒂和斯图茨尔1989)。当只有一个谱系时，所得到的曲线只是穿过数据中心的主曲线，只需要做一个调整:初始曲线是用簇中心之间的线性连接构造的，而不是数据的第一个主成分。这种调整增加了稳定性，通常会加速算法的收敛。

当有两个或多个血统时，我们在算法中添加一个额外的步骤:平均共享细胞附近的曲线。这两种谱系在尚未分化的细胞上应该相当一致，因此在每次迭代中，我们对这些细胞附近的曲线进行平均。这增加了算法的稳定性，并产生平滑的分支谱系。

crv1 <- getCurves(lin1) crv1 . txt

##类:pseudotimeorders ## dim: 140 2 ##元数据(4):lineages mst slingParams曲线## pathStats(2):伪时间权重## cellnames(140): cell-1 cell-2…cell-139 cell-140 ## cellData names(2): reducedDim clusterLabels ## pathnames(2): Lineage1 Lineage2 ## pathData names(0):

plot(rd, col = brewery .pal(9，"Set1")[cl]， asp = 1, pch = 16) lines(SlingshotDataSet(crv1)， lwd = 3, col = 'black')

的输出getCurves是已更新的PseudotimeOrdering现在它包含了同步的主曲线和关于它们如何拟合的附加信息。的slingPseudotime函数提取每个谱系中每个单元格的伪时间值矩阵，使用NA未分配给特定谱系的单元格的值。的slingCurveWeights函数提取一个类似的权重矩阵，将每个单元格分配给一个或多个谱系。

对象可以访问曲线对象slingCurves函数，该函数将返回principal_curve对象。这些对象由以下插槽组成:

• 年代:构成曲线的点的矩阵。这些对应于数据点的正交投影。
• 奥德:可用于将细胞沿曲线排列的指标，这些指标基于细胞的投影。
• λ:沿曲线从开始到每个单元投影的弧长。方法返回这些值的矩阵slingPseudotime函数。
• dist_ind:数据点与其在曲线上的投影之间距离的平方。
• 经销:投影距离平方和。
• w:沿此谱系的权重向量。明确归属于这一谱系的细胞的重量为1，而分配给其他谱系的细胞的重量为0。单元格的权重可以是1(或非常接近1)对于多个血统，如果他们在分支事件之前被定位。方法返回这些值的矩阵slingCurveWeights函数。

5.3在大型数据集上运行Slingshot

对于大型数据集，我们强烈建议使用approx_points参数与弹弓(或getCurves)．这允许用户指定曲线的分辨率。唯一点的数目)。虽然MST构造是在集群上运行的，但随着数据集规模的增长，迭代地将所有点投影到一条或多条曲线上的过程可能会变得计算负担很大。出于这个原因，我们设置为的默认值approx_points要么\ (150 \)或数据集中的单元格数，以较小者为准。这将大大降低探索性分析的计算成本，同时对所得到的轨迹影响最小。

对于最大程度的“密集”曲线，设置approx_points = FALSE，并且曲线上的点将与数据集中的单元格数量相同。然而，请注意迭代曲线拟合过程中的每个投影步骤现在都有与之成比例的计算复杂度\ (n ^ 2 \)(\ (n \)是单元格的数量)。在分支谱系存在的情况下，这些密集的曲线也会影响曲线平均和收缩的复杂性。

我们推荐的值为\ (100 \)-\ (200 \)的默认值\ (150 \)。注意，在曲线上限制唯一点的数量是可行的不对唯一伪时间值的数量施加类似的限制，如下所示。即使有一个不切实际的低值\ (5 \)为approx_points，我们仍然可以从伪时间值中看到一个全色梯度:

sce5 <- slingshot(sce, clusterLabels =' GMM'， reducedDim =' PCA'， approx_points = 5) colors <- colorRampPalette(啤酒器.pal(11，'Spectral')[-6])(100) plotcol <- colors[cut(sce5$slingPseudotime_1, breaks=100)] plot(reducedDim (sce5)$PCA, col= plotcol, pch=16, asp =1) lines(SlingshotDataSet(sce5)， lwd=2, col='black')

5.4多个轨迹

在某些情况下，我们感兴趣的是识别多个不相交的轨迹。Slingshot在最初的MST构造中通过引入一个名为ω。这个人工聚类与每个真实聚类之间有固定长度的间隔，这意味着任何两个真实聚类之间的最大距离是这个长度的两倍。实际上，这设置了MST中允许的最大边长的限制。设置= TRUE将实现一个经验规则，其中最大允许的边长等于3 \ \ ()乘以没有人工聚类构造的MST的中位数边缘长度(注意:这相当于说的默认值omega_scale是\ \ (1.5))．

rd2 <- rbind(rd, cbind(rd[，2]-12, rd[，1]-6)) cl2 <- c(cl, cl + 10) pp2 <- slingshot(rd2, cl2, omega = TRUE, start。clus = c(1,11)) plot(rd2, pch=16, asp =1, col= c(brew .pal(9，"Set1")， brew .pal(8，"Set2"))[cl2]) lines(SlingshotDataSet(ptp)， type =' l'， lwd=2, col='black')

安装MST后，弹弓继续拟合同时主曲线，每条轨迹分别处理。

plot(rd2, pch=16, asp =1, col= c(brew .pal(9，“Set1”)，brew .pal(8，“Set2”))[cl2]) lines(SlingshotDataSet(ptp)， lwd=2, col='black')