1.1什么ALDEx2做不同的

的ALDEx2包使用来自狄利克雷分布的蒙特卡罗实例估计每个样本中的每个特征的技术变化。从该分布中采样返回重复采样模型下观测数据的后验概率分布。所有输出ALDEx2是后验分布的输出，要么是期望值，要么是置信区间。

ALDEx2使用中心对数比(clr)变换(或密切相关的对数比变换)，以确保数据是尺度不变的和子组成相干的666特(1986)．尺度不变性属性消除了样本数据归一化步骤的需要，因为数据都放在一致的数值坐标上。亚成分一致性特性确保了当数据集的部分被移除时(例如，从RNA-seq研究中移除rRNA reads或从16S rRNA基因扩增研究中移除稀有OTU物种)获得的答案是一致的。所有特征丰度值都表示相对于样本中其他特征的几何平均丰度。这在概念上类似于定量PCR，其中丰度表示相对于标准:在clr转换的情况下，标准是每个样本的几何平均丰度。详见Aitchison(1986)的完整描述。

相比之下，用于分析高通量测序(HTS)数据差异丰度的最常用工具都假设通量测序数据是按计数交付的777安德斯等人(2013)；安德斯和胡贝尔(2010)；gierlizynski等人(2015)．已经做了很多工作来规范化数据集，使它们近似于这个假设888布拉德等人(2010)；迪利斯等人(2013)．即便如此，通过在不同容量的仪器上运行相同的库并尝试规范化，可以简单地证明数据是计数。特征(基因，OTUs，功能)之间的相对关系被保留，但实际的计数值没有被保留。

通过这个简单的实现，许多小组已经意识到HTS数据集实际上是计数组合999洛弗尔等人(2011)；弗里德曼和阿尔姆(2012)；费尔南德斯等人(2013)；费尔南德斯等人(2014)；Gloor等人(2017)；托马斯·p·奎因等人(2017)与计数有显著不同的统计属性101010特(1986)；Pawlowsky-Glahn, Egozcue, and Tolosana-Delgado (2015)；Pawlowsky-Glahn and Buccianti (2011)．因此,ALDEx2是一个R考虑到这些数据的计数组成性质的差异相对丰度包。

3．1生长选择型(SELEX)实验的个案研究t检验。

本节包含对收集的数据集的分析，其中单个基因库包含1600个序列变体，序列中有4个密码子131313McMurrough et al. (2014)．这些变体以等摩尔量克隆到表达载体中。该基因的野生型具有对拓扑异构酶毒素的抗性。在选择性和非选择性条件下对基因文库进行了7个独立的生长，并通过在Illumina MiSeq上对汇总的条形码文库进行测序来读取每个变体的丰度。数据表作为selex_table.txt包含在包中。在这个数据表中，有1600个特征和14个样本。分析大约需要2分钟，当我们使用128个Dirichlet蒙特卡罗实例(DMC)时，在移动i7级处理器上的内存使用量最高不到1Gb。出于速度考虑，我们只使用前400个特性，只执行16个DMC。命令用于ALDEx2如下:

首先，我们加载库和包含的selex数据集。然后我们设置比较组。这必须是与输入计数表中的样本顺序相同的条件向量。的aldex命令在后台调用其他几个函数，每个函数都返回诊断信息。在这个小插图中，这些诊断被抑制了。

library(ALDEx2) data(selex) #只集合最后400个高效selex的特征。子< - selex[1:400]气孔导度< - c(代表(“NS”,7),代表(“S”,7)x.all < - aldex (selex。sub, conds, mc.samples=16, test="t"， effect=TRUE, include.sample。summary=FALSE, denom="all"， verbose=FALSE, paired.test=FALSE) par(mfrow=c(1,2)) aldex.plot(x。all, type="MA"， test="welch"， xlab="Log-ratio丰度"，ylab="差异")all, type="MW"， test="welch"， xlab="色散"，ylab="差值")

图1:ALDEx2输出的MA和Effect图
左边的面板是Bland-Altman或MA图，显示了(相对)丰度和差异之间的关系。右边的面板是一个效果图，显示了差异和色散之间的关系。在这两个图中，不显著的特征用灰色或黑色表示。具有统计学意义的特征用红色表示。对数比丰度轴是特征的clr值。

4．1的aldex.clr模块

模块化方法的工作流首先生成中心对数比转换值的随机实例。有三个输入:计数表、条件向量和蒙特卡罗(DMC)实例的数量;和几个参数:一个字符串，指示是否iqlr，零或所有特征被用作分母，以及详细程度(TRUE或FALSE)。我们推荐128个或更多mc.样本用于t检验，1000个用于严格的效应量计算，至少16个用于方差分析。141414事实上，我们建议最小组的样本数量乘以DMC的数量至少等于1000，以便对后验分布产生合理稳定的估计

这个操作很快。

#输出在S3对象'x' x <- aldex.clr(selex. clr)sub, conds, mc.samples=16, denom="all"， verbose=F)

4.2的aldex.ttest模块

下一个操作对只有两个条件的情况执行Welch’s t和Wilcoxon秩检验。只有两个输入:来自的aldex对象aldex.clr以及是否应进行配对测试(TRUE或FALSE)。

这个操作相当快。

X.tt <- aldex。tt (x,配对。测试= FALSE, verbose = FALSE)

4.３的aldex.kw模块

除了t检验，用户还可以对两个或多个条件的单向方差分析执行glm和Kruskal Wallace检验。这里只有两个输入:来自aldex的aldex对象。Clr和条件向量。注意，这是缓慢的!在本文档中不进行计算。

x.kw <- aldex.kw(x)

4.4的aldex.effect模块

最后，我们估计了两种情况下的效应大小和条件值之间。这一步是绘图所必需的，在我们的实验室中，我们的结论主要基于这个函数的输出151515Macklaim et al. (2013)；McMurrough et al. (2014)；Bian et al.(未注明)．这里有一个输入:aldex.clr中的aldex对象;还有几个参数:是否包含所有样本的值的标志被用作分母，以及详细程度。也可以在标记中包含效应量估计的95%置信区间信息CI = TRUE．这在决定是否包含或排除特定特性时很有帮助。我们发现，一个较大的效应，但这是一个异常值的极端效应分布可能是假阳性。新增了计算配对t检验或重复样本的效应大小的选项。测试= TRUE选项。请注意，配对时不计算效应大小的置信区间。test = TRUE。

X.effect <- aldex。效果（x, CI=T, verbose=FALSE, paired.test=FALSE)

4．5的aldex.plot模块

最后，将t检验和效果数据合并为一个对象。

X.all <- data.frame(x.tt,x.effect)

数据被绘制出来。我们看到图1和图2中绘制的数据本质上是相同的。

票面价值(mfrow = c(1、2)aldex.plot (x。所有, type="MA", test="welch") aldex.plot(x.all, type="MW", test="welch")

图2:aldex的输出。绘制函数
左图为MA图，右图为MW(效应)图。在这两个图中，红色代表的特征被称为q的差异丰度\ (< 0.1 \)；灰色丰富，但没有差异丰富;黑色很少，但数量并不多。该函数使用aldex的组合输出。Ttest和aldex。影响功能

4.5.1效应置信区间

如上所述，ALDEx2包生成给定所收集数据的观察计数概率的后验分布。在这里，我们通过检查效应量的95% CI来表明这种方法的重要性。在整个过程中，我们使用了一个标准化的效应量，类似于科恩的d度量，尽管我们的效应量更稳健，也更保守(当数据为正态分布时，大约为0.7科恩的d)161616Fernandes Gloor未出版．

对比图2和图3的输出可以发现一个非常重要的一点:测序数据中存在着巨大的潜在变异。我们在图2中看到，有一些特征的期望q值在统计上有显著差异，这些特征既相对罕见，又具有相对较小的差异。即使根据预期的效应大小来识别特征也会产生误导。我们发现最安全的方法是识别那些效应量的95% CI不超过0的特征。

通过检查图表，我们发现，最稀有的特征最不可能通过简单随机抽样重现效应量。95% CI度量的行为完全符合我们的直觉:稀有特征的估计精度很差——如果你想对稀有特征有更多的信心，你必须花更多的钱来更深入地排序。

通过这种方法，我们接受了所接收数据中的生物变异171717也就是说，我们没有推断出任何额外的生物变异:也就是说，实验设计总是既定的但他们也在识别这些特征，在这些特征中，简单的随机抽样库每次都会给出相同的结果。这是在(Macklaim et al. 2013)，其结果经过独立验证，发现非常可靠(Nelson et al. 2015)．

图3:将平均效应与95% CI进行比较
左图为MA图，右图为MW(效应)图。在这两个图中，红色点表示具有预期效果值的特征\ (> 2 \)；蓝色圆圈表示95% CI不与0重叠;灰色是不感兴趣的特征。这个图只使用了aldex的输出。影响的功能。效果图中的灰线表示effect=2等值线。

4.6复杂的研究设计和碱性物质。全球语言监测模块

aldex。GLM模块被包括在内，因此概率组合方法可以用于复杂的研究设计。这个模块比上面的两个比较测试慢得多，但我们认为如果你有复杂的研究设计，它是值得的。

从本质上讲，该方法是上面的模块化方法，但使用模型矩阵和协变量提供给r中的glm函数。返回的值是给定输入的glm函数的期望值。在下面的例子中，我们分别测量变量A和B的预测值。请参阅R公式函数的文档，或http://faculty.chicagobooth.edu/richard.hahn/teaching/formulanotation.pdf获取更多信息。

在aldex识别的任何变量下的差异特征的验证。GLM函数应使用aldex执行。作为事后测试的效果功能。

请注意,aldex.clr将接受分母项= "所有"或者当提供模型矩阵时，用户定义的分母偏移向量。因此，当打算下游分析时aldex.glm函数只有这两个分母选项可用。这将在以后的版本中解决。

数据(selex) selex。sub <- selex[1:500，]协变量<- data.frame("A" = sample(0:1, 14, replace=TRUE)， "B" = c(rep(0,7)， rep(1,7))， "Z" = sample(c(1,2,3)， 14, replace=TRUE)) mm <- model。矩阵(~ A + Z + B，协变量)x <- aldex.clr(selex. clr)sub, mm, mc.samples=4, denom="all"， verbose=F) glm。测试<- aldex。全球语言监测机构(x毫米)

## |------------( 25 %)----------( 50 %)----------( 75年 %)----------|

全球语言监测机构。- aldex.glm.effect(x)

的aldex.glm.effect函数将计算矩阵中所有二元模型的效应大小。每个二元预测器的效应量计算输出到一个命名列表。这些效应大小和输出aldex.glm可以在下面的示例代码块中绘制，该代码块绘制了实际测试用例的bh校正glm值与二进制预测器的效应大小。

aldex.plot (glm)。效果[["B"]], test="effect", cutoff=2) sig <- glm.test[,20]<0.05 points(glm.effect[["B"]]$diff.win[sig], glm.effect[["B"]]$diff.btw[sig], col="blue") sig <- glm.test[,20]<0.2 points(glm.effect[["B"]]$diff.win[sig], glm.effect[["B"]]$diff.btw[sig], col="blue")

5.1预期值

一个ALDEx2返回汇总统计信息的预期值。值得注意的是，ALDEx使用来自Dirichlet分布的贝叶斯抽样来估计潜在的技术变化。这是由的数量控制的，在实践中我们发现，对于大多数情况下，将其设置为16或128就足够了ALDEx2是估计分布的期望值吗181818费尔南德斯等人(2013)；费尔南德斯等人(2014)；Gloor等人(2016)．

实际上，ALDEx2采用给定的生物学观察结果，但多次使用的方法推断技术变化(同一样品再次测序)aldex.clr函数。因此，返回的期望值是那些可能已经被观察到的值。用户需要注意的是，由于这个采样过程，被称为差异的特征的数量在不同的运行之间会有所不同。然而，只有值接近所选显著性截断值的特征才会在运行之间发生变化。

有几篇论文提出了这一点ALDEx2无法适当控制错误发现率，因为返回的P值并不遵循随机均匀分布，而是倾向于聚集在0.5附近191919Hawinkel等人(2018)；索尔森等人(2016)．这些研究表明，点估计方法对特定的实验设计以及稀疏性和读取深度的差异非常敏感。然而,ALDEx2对数据的这些特征并不敏感，但似乎低估了真实的罗斯福。这些批评没有切中要害ALDEx2因为ALDEx2报告横跨Dirichlet蒙特卡洛复制的P值。仅仅因为随机抽样的不确定性而产生差异的特征确实会有一个随机统一的P值作为点估计，但在重复随机抽样0.5后会有一个期望P值。相比之下，由于真实生物变异而产生差异的特征对重复随机抽样具有鲁棒性。因此,ALDEx2仅将简单随机抽样(最小零假设)无法解释差异的特征识别为差异。

根据我们的经验，我们观察到这一点ALDEx2返回一组与作为多个独立工具交叉返回的集非常相似的特征，这是检查HTS数据集时的常见建议20.20.20.Soneson and Delorenzi (2013)

5.2解释输出

在下面的列表中，aldex.ttest函数返回突出显示的值ast \ \ (\),aldex.kw函数返回突出显示的值\(\保监会\)，以及aldex.effect函数返回突出显示的值\ \ diamondsuit \ ()．

1. ast \ \ (\)we.ep- Expected P value of Welch’s t test
2. ast \ \ (\)we.eBH- Expected Benjamini-Hochberg corrected P value of Welch’s t test
3. ast \ \ (\)wi.ep- Expected P value of Wilcoxon rank test
4. ast \ \ (\)wi.eBH- Expected Benjamini-Hochberg corrected P value of Wilcoxon test
5. \(\保监会\)kw.ep - Kruskal-Wallace检验的期望P值
6. \(\保监会\)kww . ebh - Kruskal-Wallace检验的期望Benjamini-Hochberg校正P值
7. \(\保监会\)glm.ep- Expected P value of glm test
8. \(\保监会\)glm.eBH- Expected Benjamini-Hochberg corrected P value of glm test
9. \ \ diamondsuit \ ()rab.all- median clr value for all samples in the feature
10. \ \ diamondsuit \ ()NS - NS组样本的clr中值
11. \ \ diamondsuit \ ()b.win.S - S组样本的clr中值
12. \ \ diamondsuit \ ()rab.X1_BNS。q50 -样本X1_BNS中特征的中值表达值include.item.summary = TRUE
13. \ \ diamondsuit \ ()dif。btw - S组和NS组之间clr值的中位数差异
14. \ \ diamondsuit \ ()dif。win - S组和NS组中clr值最大差异的中位数
15. \ \ diamondsuit \ ()效果-中值效果大小:所有实例的diff.btw / max(diff.win)
16. \ \ diamondsuit \ ()重叠-重叠0的效果大小的比例(即没有效果)

5.3关于效应大小和重叠

所使用的效应量度量ALDEx2是专门为此包开发的标准化分布效应量度量。该测量方法在一定程度上是稳健的，允许20%的样本在值受到影响之前是异常值，返回正态分布上Cohen’s d大小的71%的效应量，并且最坏情况下需要两倍的样本数量，因为全参数方法(不稳健)将以相同的精度估计值。度规对正态分布、随机均匀分布和柯西分布同样有效^(（?？?）提交)。

我们更喜欢尽可能使用效应量，而不是统计显著性，因为效应量告诉科学家他们想知道的东西——“各组之间有什么可重复的差异”;这显然不是P值提供的东西。我们发现，与基于P值的方法不同，使用效应量返回一致的真正特征集，而不考虑样本量。此外，在低样本量下观察到的一半以上的假阳性特征具有和效应量\(> 0.5 \times \math {E}\)选择的效果大小截止\ (\ mathrm {E} \)．这与数据集的来源无关(（?？?）提交)。

我们建议在分析HTS数据集时使用1或更大的效应大小截止值。如果用户愿意，还可以设置折叠变化截止点，就像通常使用基于P值的方法一样。

下图显示了测试数据集中效应量和P值以及bh调整P值之间的关系。

par (mfrow = c(1、2))(x。所有影响美元,美元x.all我们。ep, log="y"， cex=0.7, col=rgb(0,0,1,0.2)， pch=19, xlab="效应大小"，ylab="P值"，main="效应大小图")点(x。所有影响美元,美元x.all我们。eBH cex = 0.7, =上校rgb (1 0 0, 0.2), pch = 19) abline (h = 0.05, lty = 2, =“灰色”)上校的传奇(15 1传说= c(“P值”、“BH-adjusted”),pch = 19日坳= c(“蓝”、“红”))情节(x.all diff美元。顺便说一句,x.all我们美元。ep, log="y"， cex=0.7, col=rgb(0,0,1,0.2)， pch=19, xlab="差值"，ylab="P值"，main="火山图")顺便说一句,x.all我们美元。eBH cex = 0.7, =上校rgb (1 0 0, 0.2), pch = 19) abline (h = 0.05, lty = 2,坳=“灰色”)

图4:效应、差值和P值之间的关系
我们可以看到，效应量与P值的关系比原始差紧密得多。整个数据集的效应量相对稳定，但P值随着样本量的增加而逐渐变小。

5.3.1输出的可选绘图

内置的aldex。绘制函数described above will usually be sufficient, but for more user control the example in Figure 4 shows a plot that shows which features are found by the Welchs’ or Wilcoxon test individually (blue) or by both (red).

#确定哪些值在t检验和GLM检验中都是重要的。eBH < 0.05 & x.all$wi。eBH < 0.05) #识别哪些值在小于所有测试found.by.one <- which(x.h all$we。eBH < 0.05 | x.all$wi。eBH < 0.05) #绘制数据图的内部和之间的变化(x.h all$diff。赢,x.all diff美元。btw, pch=19, cex=0.3, col=rgb(0,0,0,0.3)， xlab="色散"，ylab="差异")一),(found.by x.all diff.btw美元。1]， pch=19, cex=0.7, col=rgb(0,0,1,0.5))点(x.all$diff.win[find .by. by.]所有],x.all diff.btw美元[found.by。所有], pch=19, cex=0.7, col=rgb(1,0,0,1)) abline(0,1,lty=2) abline(0,-1,lty=2)

图5:使用Welch 's t检验或Wilcoxon秩检验的selex数据集中的差异丰度
两个测试识别的特性用红色显示。仅通过一次测试识别的特征用蓝点表示。非显著特征用黑色表示稀有特征，用灰色点表示丰富特征。

7.1纠正不对称的方法

的aldex.clr函数结合了多种方法来选择最能处理非对称数据集的分母:

注意:任何行都不应该包含全部0值，因为它们将被删除aldex.clr函数

1. 所有:默认是使用艾奇逊的中心对数比计算所有特征的几何平均值212121特徵:1986．这是组合数据分析方法的默认方法。

2. _iqlr:iqlr方法识别在整个数据集中表现出可再现方差的那些特征。这叫做四分位间对数比iqlr的方法。为此，对数据集应用0.5的统一先验，应用clr变换，并计算每个特征的方差。那些方差值落在数据集中所有组中所有特征方差的第一和第三四分位数之间的特征将被保留。当aldex。称为CLR，只计算保留特征的几何平均丰度，并用作对数比计算的分母。建模表明，这种方法在处理高达25%的特征不对称的数据集时是有效的。这种方法的优点是它对对称数据集影响很小或没有影响，因此如果用户不确定数据是否轻度不对称，则是一种安全的方法。

3. lvha:该方法识别了在每组方差的底部四分位数和在每个样本的相对丰度的顶部四分位数以及在整个数据集中的那些特征。当群体非常不对称时，这种方法是合适的，但有一些特征预计是相对恒定的。这里的基本思想是识别那些在所有样本中相对恒定的特征，类似于将被选为qPCR内部标准的特征。经验表明，元基因组和元转录组数据集可以从这种选择分母的方法中受益。此方法不适用于selex数据集，因为没有符合标准的特征。

4. 零:这种方法只识别和使用每组中非零的特征。在这种方法中，使用每组非零特征时aldex.clr计算CLR变换中的几何平均值。这种方法在群体非常不对称的情况下是合适的，但实验人员必须问，在这些极端情况下，这种比较是否有效。

5. 用户:最后一种新方法是让用户定义一组“不变”特征。在元rna-seq的例子中，可以认为管家基因的水平应该是所有样本的标准。在这种情况下，用户可以定义与特定的管家基因集相对应的行索引作为标准。

6. 迭代:该方法使用选择的统计检验来识别组间没有统计学显著差异的特征。可与其他方法结合使用。

图5显示了iqlr校正对示例数据集的影响。当分母是全部时，我们可以看到大部分点都落在中点(虚线)上，但是对于iqlr和lvha分析，大部分点都集中在0附近。因此，在后两种方法中，我们可以明显更好地集中数据。实际上，在iqlr或lvha变换后，我们改变了显著性边缘附近特征的p值和效应量。对于那些接近大量数据点的特征，这种影响是最大的。

首先是代码:

# x@denominator data(synth2) block中的分母特征<- c(rep("N"， 10)，rep("S"， 10)) x <- aldex。Clr (synth2, blocks, denom="all") x.e <- aldex.effect(x) plot(x.e$diff。赢,x.e diff美元。Btw, pch=19, col=rgb(0,0,0,0.1)， cex=0.5, xlab="色散"，ylab="差异"，main="所有")点(x.e$diff。赢得[x@denom], x.e diff美元。顺便说一句[x@denom], pch = 19日坳= rgb (0.8, 0.5, 0, 0.7), cex (x.e diff美元= 0.5)点。赢得[47:86],x.e diff美元。顺便说一句[47:86],坳= rgb (0.7 0.8, 0, 0), cex (x.e diff美元= 0.5)点。赢得[980:1000],x.e diff美元。顺便说一句[980:1000],坳= rgb (0.7 0.8, 0, 0), cex = 0.5) abline (0, 1) abline (0, 1) abline (h = 0,坳=“灰色”,lty = 2)

图6:使用不同分母进行clr计算的合成数据集中的差异丰度
在这些数据中，2%的特征在一组中被建模为稀疏，而在另一组中则不是。两组之间不同的特征用红色表示。不重要的特征显示为灰色(或棕色)。棕色所示的分母中使用的特征:在计算clr变换时，这些特征的几何平均值被用作分母。在0和\下午(\ \)1.注意iqlr和lvha分母放在非对称特征的中间，组间差异为0。