2.1所需的外部软件工具

MAGAR的功能安装叮铃声用于处理基因分型数据。按照可用的安装说明进行安装在这里并指定包的安装路径qtlSetOption (plink.path =“path_to_plink”)．

此外，根据分析的类型，需要更多的外部软件工具()。更具体地说，如果您想执行imputationbgzip而且tabix从htslib包装是需要的，以及vcftools用于分类VCF文件。最后，如果要通过fastQTL时，需要安装的软件工具和指定的可执行文件的位置MAGAR使用qtlSetOption函数的值bgzip.path，tabix.path，vcftools.path，fast.qtl.path．

3．1DNA甲基化数据(微阵列)

MAGAR应用广泛RnBeadsDNA甲基化数据导入软件包。因此,MAGAR中提供的各种输入选项RnBeads，包括直接从基因表达Omnibus (GEO)， IDAT和BED文件下载。有关更多选项，请参阅RnBeads装饰图案和文档。除了原始甲基化数据外，还需要提供一份说明待分析样品的样品注释表。该表格包含每个示例的一行，如下所示:

SampleID，年龄，性别，条形码Sample_1,14,f,209054857842_R01C01 Sample_2,42,f,209054857842_R02C01 Sample_3,45,m,209054857842_R03C01

有关导入过程的详细信息，请参阅RnBeads装饰图案．最重要的是，需要为的导入和预处理模块指定分析选项RnBeads．MAGAR提供默认设置，该设置可在extdata / rnbeads_options.xml．你可以使用这个文件作为你自己设置的模板，然后将它指定给包:

opts <- rnb.xml2options(system.file("extdata"，"rnbeads_options.xml"，package="MAGAR"))Column ="geo_accession"， import. dat.platform="probes450") xml。fi <- file.path(getwd()，"rnbeads_options.xml") cat(rnb.options2xml()，file=xml.fi) qtlSetOption(rnbeads. path)Options = xml.fi)

3.2基因分型数据

基因族群。Dir <- "plink_data" rnb. txt。Set <- load.rnb.set("rnb_set_dir") s.a no <- "sample_annotation.csv" data. Set <- "rnb_set_dir")loc <- list(idat.dir=rnb.set,geno.dir=plink.dir) qtlSetOption(geno.data. dir=rnb.set)Type ="plink"， meth.data. Type ="rn .set")qtl <- doImport(data.location=data. location)loc s.anno =。伊斯兰教纪元,s.id。坳= " SampleID " out.folder = getwd ())

SampleID，年龄，性别，条形码，GenoSentrixPosition Sample_1,14,f,209054857842_R01C01,9701756058_R05C01 Sample_2,42,f,209054857842_R02C01,9701756058_R07C01 Sample_3,45,m,209054857842_R03C01,9742011016_R04C01

qtlSetOption (impute.geno。data=TRUE, impuation .reference.panel="apps@hrc-r1.1"， impuation .phasing。方法= " shapeit”,归责。人口=“欧元”)

3．3执行数据导入

的doImport函数需要到各自的基因分型和DNA甲基化数据的路径，以及前面讨论的样本注释表。在这篇短文中，我们将描述DNA甲基化数据的导入IDAT格式和基因分型数据叮铃声文件。首先，您必须指定对应的路径IDAT而且叮铃声文件。此外，您必须在样本注释页中指定样本标识符列，以确定基因分型和DNA甲基化数据中的样本。对于较大的文件，我们建议激活将大型矩阵存储在磁盘上而不是主存中的选项(hdf5dump)．

对于估算数据，不对基因分型数据进行进一步处理，剂量值按原样使用:

idat.dir<- "idat_dir" geno.dir <- "geno_dir" anno.sheet <- "sample_annotation.tsv" qtlSetOption(hdf5dump=TRUE) imp.data <- doImport(data.location = c(idat.dir=idat.dir,geno.dir=geno.dir), s.anno = anno.sheet, s.id.col = "ID", tab.sep = "\t", out.folder = getwd())

请注意recode.allele.frequencies选项指定，是否根据所分析的队列，根据可用样本中的等位基因频率重新编码SNP参考和替代等位基因。或者，dbSNP本地版本的路径(Sherry et al. 2001)可透过db.snp.ref，并自动从数据库中解析引用/替代等位基因信息。如果要执行imputation，这一点尤其重要，因为Michigan imputation Server对引用不匹配非常敏感。

4．1计算CpG相关块

由于相邻的CpG通常高度相关，因此单独使用每个CpG作为潜在的methQTL候选对象会导致许多冗余结果。因此，我们的目标是近似DNA甲基化单倍型通过确定附近高度相关的cpg。这个过程本身分为六个步骤，并且分别对每个染色体进行:

1. 计算所有cpg之间的(Pearson)相关矩阵(进一步的相关类型可在选项中获得)correlation.type）
2. 从相关矩阵构建距离矩阵
3. 丢弃相关性低于给定阈值的所有交互(选项:cluster.cor.threshold）
4. 根据两个cpg之间的基因组距离加高斯(选项:standard.deviation.gauss)．标准差值越高，对远端cpg的惩罚越低，因此聚类会变大。
5. 放弃所有超过该选项的交互absolute.distance.cutoff
6. 计算由距离矩阵引起的无向加权图上的鲁汶聚类

这将根据相邻cpg之间的相关结构返回一个聚类，稍后我们将使用该结构调用methQTL。请注意，我们使用模拟实验来单独确定每种数据类型的参数。它们将自动为所使用的数据集加载，并且是:

• 450 k:cluster.cor.threshold= 0.2,standard.deviation.gauss= 5000,absolute.distance.cutoff= 500000
• 史诗:cluster.cor.threshold= 0.2,standard.deviation.gauss= 3000,absolute.distance.cutoff= 500000
• rrb / WGBS:cluster.cor.threshold= 0.2,standard.deviation.gauss= 250,absolute.distance.cutoff= 500000

4.2每个相关块调用methQTL

从相关块列表中，MAGAR计算methQTL与同一染色体上所有snp的相互作用。这个过程分为三个步骤:

1. 根据该选项指定，计算每个相关块的代表CpG(标签-CpG)representative.cpg.computation(默认值:row.medians)．
2. 丢弃所有大于的snpabsolute.distance.cutoff(默认值:1,000,000)远离代表性CpG
3. 通过使用线性模型调用methQTL。有多个可用的methQTL调用选项，可以通过该选项进行选择linear.model.type(默认值:classical.linear)．另外,fastQTL可以设置为meth.qtl.type．这将告诉包使用fastQTL软件(Ongen et al. 2016)．

的meth.qtl.type说明了如何定义methQTL交互，并提供了三个选项fastQTL：

1. oneVSall:一个CpG只能受一个SNP的影响。我们选择p值最小的那个。
2. twoVSall:一个CpG既可以受到两个独立snp的积极影响，也可以受到消极影响。该包将输出那些满足p值截断的值。
3. allVSall:对于每个CpG，所有显示p值低于p值截断值的snp将被返回。

在methQTL调用过程中，可以使用该选项指定潜在的协变量sel.covariates．我们建议至少包括年龄而且性作为协变量，因为它们对DNA甲基化模式有很强的影响。

5.1如何使用methQTLResult

上面的过程将创建一个class对象methQTLResult，其中包含在前一步中调用的methQTL。要获得包含所有methQTL的表，需要从对象中提取信息。在下面的大多数函数调用中，都有选项类型* ' SNP ':表征影响任何DNA甲基化状态的SNP * ' CpG ':表征受任何SNP基因型* ' cor影响的每个相关块的代表性CpG。block ':描述所有CpG，这些CpG是相关块的一部分，其代表CpG受任何基因型的影响

此外，您可以获得涉及methQTL相互作用的cpg和snp的基因组注释:

结果。table <- getResult(meth.qtl.res) head(result.table)

庵野。meth <- getAnno(meth.qtl.res，"meth") head(no.meth)

庵野。geno <- getAnno(meth.qtl.res，"geno") head(no.geno)

有关输出的更详细信息，请参见函数getResultsGWASMap．

5.2情节

为了可视化methQTL，MAGAR提供一些绘图功能。大多数函数返回类型的对象ggplot，以便日后储存或浏览。可以在一个图中同时显示所有的methQTL，也可以显示特定的methQTL:

结果。table <- result.table[order(result.table$P.value, deleting =FALSE)，] qtlPlotSNPCpGInteraction(imp.data,result.table$CpG[1]，result.table$SNP[1])

## ' geom_smooth() '使用公式'y ~ x'

qtlDistanceScatterplot (meth.qtl.res)

5.3解释功能

这个包提供了一堆解释函数来描述检测到的methqtl。包括LOLA富集分析(Sheffield and Bock 2016)（qtlLOLAEnrichment)，基于ensemble regulatory Build定义的假定调控元素的基因组注释丰富(Zerbino et al. 2015)（qtlAnnotationEnrichment)、snp中不同碱基取代的富集分析(qtlBaseSubstitutionEnrichment)，或TFBS motif富集使用TFBSTools．对提供的方法中可用的methqtl进行充实比较methQTLResult(对于单个输入)，或到重叠qtl的列表methQTLResult．浓缩的背景被定义为所有被用作methQTL调用输入的snp / cpg。

res <- qtlbasesreplactionenrichment (meth.qtl.res)

5.4methQTL结果列表

上面讨论的大多数函数都支持单一的methQTLResult作为输入，或此类对象的列表。在指定列表的情况下，函数通常会重叠找到的methQTL，并将其与用于调用methQTL的所有snp / cpg进行比较。此外，还有一些函数特别适用于methQTLResult对象和执行重叠的对象，或者确定特定于数据集的methqtl。

meth.qtl.res。2<- loadMethQTLResult(system.file("extdata","MethQTLResult_chr18",package="MAGAR")) meth.qtl.list <- list(First=meth.qtl.res,Second=meth.qtl.res.2) qtlVennPlot(meth.qtl.list,out.folder=getwd())

##加载所需的命名空间:VennDiagram

qtlUpsetPlot (meth.qtl。List,type = "cor.block")

## 2022-04-26 17:02:44 1.7 STATUS STARTED获取对象1的相关块为对象1 ## 17:02:44 1.7 STATUS STARTED获取对象2的相关块为对象2 ## 2022-04-26 17:02:44 1.7 STATUS COMPLETED获取对象2的相关块为对象2 ##为对象1获取关联块的STATUS COMPLETED为对象1获取关联块的STATUS STARTED为对象2获取关联块的STATUS COMPLETED为对象2获取关联块的STATUS COMPLETED重叠

spec.first <- getSpecificQTL(meth.qtl.list$First,meth.qtl.list[-1])

6.1MAGAR选项

MAGAR是一个灵活的软件包，允许多种类型的methQTL分析。在这里，我们将在一个表中展示描述分析的不同选项，并讨论选择非默认选项时可能出现的问题。大多数选项都有合理的默认值，这些默认值是通过模拟实验确定的。有关详细信息，请参阅的文档qtlSetOption

6.2雇佣MAGAR科学计算集群

MAGAR可以在使用Sun Grid Engine (SGE)技术设置的高性能计算集群上自动分配作业。你可以通过这个选项cluster.submit来doMethQTL从而激活集群提交。注意，您还必须指定可执行文件的路径Rscript并可能使用选项设置指定资源需求cluster.config．

qtlSetOption(集群。qtlSetOption(rscript. config = c(h_vmem="60G"，mem_free="20G"))path = "/usr/bin/Rscript") meth.qtl.res <- doMethQTL(meth. qtl)QTL = imp.data, cluster。提交= T)