RiboDiPA R包

0。Ribo-DiPA包装器函数

对用户的方便,我们提供了一个包装器函数,允许执行Ribo-DiPA管道,最低限度需要GTF文件和BAM文件,由实验和复制。

# #从GitHub下载示例文件图书馆(BiocFileCache)file_names < -c(“WT1.bam”,“WT2.bam”,“MUT1.bam”,“MUT2.bam”,“eg.gtf”)url < -“https://github.com/jipingw/RiboDiPA-data/raw/master/”黄东海< -BiocFileCache()bam_path < -bfcrpath(均paste0(url, file_names))

这将产生一个四BAM文件列表:WT1。bam, WT2。bam, MUT1。bam, MUT2。bam,代表两个生物复制的野生型细胞和不丹突变细胞,分别。这些文件子集的BAM间隔chrIV:使用samtools 553166 - 581762,这是一个大约30 kb地区包含16个基因。另外,用户可以声明的名字BAM文件直接在一个向量。

我们建议用户使用相同的GTF文件用于生产实验比对。例如,GTF文件来自运用不会使用BAM文件与来自UCSC GTF文件。如GTF文件。”gtf”,提供的包是改编自运用,酿酒酵母R64-1-1发布,和第四号染色体上只包含特性。用户也可以直接申报gtf文件。

# #让实验类标签classlabel < -data.frame(条件=c(“变异”,“变异”,“野生型”,“野生型”),比较=c(2,2,1,1))rownames(classlabel) < -c(“mutant1”,“mutant2”,“wildtype1”,“wildtype2”)

由RiboDiPA类标签决定了比较,和最低限度需要列命名比较标签参考条件“1”和“2”治疗条件,包括选择的条件相比,不应标以“0”。在这种情况下“野生型”表示参考条件,和“突变”代表了治疗。

# #运行RiboDiPA管道使用默认参数结果。wrp < -RiboDiPA(bam_path [1:4],bam_path [5),classlabel,核=2)

的RiboDiPA ()函数是一个包装器函数,调用所有其他必要功能的方案。这个包装器的默认方法都自动生成映射P-sites p区补偿和自适应装箱的,尽管所有可用参数包的其他功能可以被修改的包装。

这个论点核指定数量的CPU核中使用计算。用户应该取代它的最大可用内核数量的最大计算效率(unspeficied或离开它,在这种情况下,内核的数量设置为的价值detectCores(逻辑= FALSE))。

从RiboDiPA # #查看表的输出头(result.wrp美元基因(订单(result.wrp美元基因美元qvalue)))# > tvalue pvalue qvalue7.135543 # > YDR050C e-02 1.788608 e-18 1.413000 e-166.267031 # > YDR064W e-02 6.599787 e-07 2.606916 e-054.701957 # > YDR062W e-02 3.167373 e-02 8.340748 e-011.646677 # > YDR059C e-01 1.259123 e-01 1.000000 e + 004.576056 # > YDL019C e-05 1.837478 e-01 1.000000 e + 00# > YDR143C 9.665726 e 03 3.227685 e-01 1.000000 e + 00

的RiboDiPA ()函数输出一个与他们的基因列表\ \ (T)值,\ (p \)值,调整\ (p \)值表示,中存储值基因,以及其他中间计算中使用的数据对象。在大多数情况下,我们希望用户将被调整\ (p \)价值为了看到最重要的全基因组的基因,我们上面显示。基因YDR049-YDR065位于区间选择的装饰图案,我们可以清楚地看到非常重要的基因达到TPI1和RPS13(分别YDR050C和YDR064W)\(问\)值1.41 e-05 e-16和2.61。

在随后的章节中,我们将更详细地走过相应的功能。

1。p区映射

p区是mRNA的确切位置,已经由核糖体翻译,增加新生链的多肽(共价连接到tRNA)所在地。在实践中,RPF已对齐的基因组有不同长度,因此一个过程需要给定RPF映射到p区位置更清楚地了解核糖体转化活动。

的psiteMapping ()函数将输入数据,并使用指定的规则映射rpf P-sites,或自动生成这些规则使用过程中描述Lauria et al (2018)。此外,如果有多个亚型记录样本,利用相同的外显子的基因组,是很困难的(或不可能)在给定RPF分配给一个特定的记录在一个Ribo-seq实验。RiboDiPA绕过这个问题,所有的外显子结合成为“全记录”并执行测试在基因水平。因此,除了p区偏移生成和映射,psiteMapping ()为每个外显子函数还生成总记录坐标。

# #执行个体p区映射过程data.psite<-psiteMapping(bam_file_list =bam_path [1:4),gtf_file =bam_path [5),psite.mapping=“汽车”,核=2)

p区映射输出值的列表:报道,覆盖在每个基因;计数每个基因,P-sites计数的数量;外显子,总记录坐标中的每个外显子基因和基因组坐标;和psite.mapping补偿,p区映射。为报道对应于复制对象,行和列对应于核苷酸位置对总记录。同样的,对计数对象,行代表基因和列代表样本。现在,让我们检查补偿功能:自动生成的

# # p区映射抵消规则生成data.psite美元psite.mapping

(列出的阅读卢旺达爱国阵线的长度是qwidth),其次是5 '末端的核苷酸抵消(psite)。例如,读取长度28 12有一个偏移量,这意味着p区将映射12核苷酸5 '末端的阅读。

如前所述,最优p区偏移量从5 '端读取校准使用两步算法的起始密码子全基因组,密切关注Lauria et al(2018)的过程。首先,对于一个给定的读取长度、偏移量计算通过的第一个核苷酸之间的距离起始密码子和5’最核苷酸的读,然后将抵消定义为5的位置最读取映射到它。重复这个过程对于所有读取长度,然后临时的抵消全球抵消定义读取长度与最大计数。最后,对于每个读取长度,调整抵消被定义为一个局部最大值对应的配置文件中找到起始密码子最近临时全球抵消。

不足的读取映射到起始密码子,我们建议用户使用中心选择要阅读的中心p区,或提供自己的抵消规则,只需用一个矩阵两列,标记qwidth和psite,传递到psite.mapping参数的psiteMapping ()函数。我们注意到指定的固定规则p区补偿可能特别有用当比较不同实验中收集相同的有机体,以确保一致性的比较。

# #使用用户指定psite映射抵消规则偏移量< -cbind(qwidth =c(28,29日,30.,31日,32),psite =c(18,18,18,19,19))data.psite2<-psiteMapping(bam_path [1:4],bam_path [5),psite.mapping=偏移量,核=2)

最后,psiteMapping ()函数使用并行计算包doParallel加快P-sites映射的过程。利用这个特性,指定使用可用的处理器数量的工作核参数。如果核没有指定,该函数将自动检测核心的数量在你的电脑上运行并行工作。

2。装箱数据

一旦读取被映射到P-sites在各种实验中,下一步是本映射P-sites一起允许统计测试。最小的本可以想象是single-codon(三核苷酸)将提供最高分辨率的装箱,但是需要一些实际问题。例如,很长的基因将会有更多的基码,因此多重假设检验校正后,只有最明显的扰动将显示统计学意义的基因。另外,最大的本是使用整个基因作为一个本,虽然整个基因位置信息将丢失。因此,一个健壮的方法来选择正确的每个基因允许发现本大小是必要的,这是RiboDiPA适应面元法的本质。

自适应方法使用过程基于Freedman-Diaconisis规则来选择一个最优的箱数相等宽度对于每个基因,在不同的基因会有不同的本宽度,但是垃圾箱的位置和数量的基因是相同的复制和条件允许测试。

# # p区数据合并到垃圾箱与一个固定的或自适应宽度数据。本ned <-dataBinning(data =data.psite美元报道,bin.width=0,zero.omit=假,bin.from.5UTR =真正的,核=2)

这个函数dataBinning ()返回一个列表被p区足迹矩阵。在每一个矩阵,行对应于复制,列对应于垃圾箱。如果参数bin.width没有指定或设置为零,这表明该函数将运行在自适应装箱方式(而不是宽度固定的模式,见下文)。一般来说,我们建议使用自适应装箱,由于大多数Ribo-seq实验是稀疏的几个数字读取,每个密码子上。

如果zero.omit参数设置为真正的0,垃圾箱在所有复制从微分模式分析中删除。当总记录的长度不是整数箱宽度的倍数,装箱将从5 '末端开始bin.from.5UTR参数是真正的,否则或3 '末端。一般来说,本宽度等于每本在总的成绩单,除了最后两箱,调整,以防止最后一本很小的情况下,本宽度不分裂的总记录长度均匀。

# #合并p区数据在每一个密码子数据。codon <-dataBinning(data =data.psite美元报道,bin.width=1,zero.omit=假,bin.from.5UTR =真正的,核=2)

在覆盖范围允许的情况下,用户还可以指定一个固定宽度的本,一直到1,代表single-codon决议。这可以用于研究在区域细节,很可能转化监管的变化,即在启动和停止密码子。例如,我们调查了50码上游和下游的停止和启动密码子分别确定一个终止密码子附近堆放核糖体的模式在不丹的情况下删除(见李等人,2020)。

# #合并p区数据在每一个外显子和执行微分模式分析结果。外显子< -diffPatternTestExon(psitemap =data.psite,classlabel =classlabel,方法=c(“gtxr”,“qvalue”))

在这种情况下,用户更愿意使用外显子的垃圾箱统计测试,我们提供了一个函数调用diffPatternTestExon ()。这个函数数据装箱和微分模式测试滚成一个qw函数和输出相同的结构diffPatternTest ()函数。等生物酵母选择性剪接是最小的,这个选项可能不是很有用,但对于更高的生物和许多外显子和可变剪接得多,它可能提供有用的见解。

3所示。微分模式分析

一旦合适的箱子已经生成,RiboDiPA包执行微分模式测试p区计数本由本为每一个基因。短暂,统计建模叫垃圾箱的负二项分布在统计上有显著差异的条件下,然后最小的假定值对于一个给定的基因调整控制多个假设检验在所有基因。

# #执行微分模式分析结果。pst < -diffPatternTest(data =data.binned,classlabel =classlabel,方法=c(“gtxr”,“qvalue”))

的diffPatternTest ()函数的输出数据作为输入不了了之,也需要一个类标签对象,描述的比较。的类标签对象只是一个数据帧两列,条件和比较,在那里条件标签的条件测试,比较标签数值实验条件,“1”表示控制条件,“2”表示治疗条件,和“0”表示复制,不应相比,如果存在。

这个函数的输出是一个列表,其中包含一个数据帧对象基因以及其他对象存储中间计算。基因包含能够\ \ (T)值,\ (p \)值,\(问\)值(如果\(问\)值被指定为多重比较的度量误差修正)的基因。的本对象包含料位检测\ (p \)值和相应的调整\ (p \)每个基因值为每一本。

\ \ (T)价值,料位\ (p \)价值,料位调整\ (p \)价值,能够调整\ (p \)价值和\(问\)由qvalue测量值(在本例中)的所有基因。的能够\ (p \)价值和\(问\)价值是主要的测试的结果,因此包的主要输出。

此外,\ \ (T)价值是一个量化的补充数据的大小差异条件下,与大量表明更大的差异。的\ \ (T)价值的定义是1-cosine第一右奇异向量的夹角的足迹矩阵两个条件下的比较。范围从0 - 1,大值代表更大的条件之间的差异,实际上,可以用来识别基因更大的大小模式差异统计学意义。这可能有助于调查人员优先调查众多,某些基因可能通过微分模式的显著性检验。

可选地,用户可以指定使用哪个方法修正错误的多重假设检验。的\(问\)值方法qvalue包是罗斯福的默认方法控制,能够和混合Hochberg-Hommel方法gtxr从精英主义pacakge多样性的默认方法校正料位。其他选项定义的包精英主义由选择调用参数的方法。

4所示。策划和基因组可视化

RiboDiPA足迹数据可视化的两个情节功能实现和测试结果包括:1)个体基因的景观策划总记录;和2)跟踪策划通过基因组浏览器使用R包igvR。

# #情节每核苷酸跟踪指定的核糖体基因。plotTrack(data =data.psite,genes.list=c(“YDR050C”,“YDR064W”),复制=零,外显子=假)

# #阴谋被核糖体基因显著的轨迹:YDR086C YDR210W。# #你可以指定thrshold重新定义显著水平情节(结果=result.pst,genes.list=零,阈值=0.05)

跟踪策划通过基因组浏览器

三个功能,bpTrack (),binTrack (),exonTrack (),提供支持跟踪策划通过基因组浏览器利用igvR。使用可以检查基因组核糖体足迹的景观和微分模式测试结果。所有三个函数输出农庄对象作为输入igvR分别为跟踪可视化RPF碱基对,封存RPFdiffPatternTest ()与微分模式测试结果,和RPF通过外显子测试结果。

可视化这些痕迹在基因组浏览器,用户应该安装igvR通过Bioconductor。下面给出一些简单的例子说明。

# # base-bair RPF轨道图书馆(igvR)用力推< -0.05igv < -igvR()setBrowserWindowTitle进口,“核糖体足迹跟踪例子”)setGenome进口,“saccer3”)数据(data.psite)names.rep<-c(“mutant1”,“mutant2”,“wildtype1”,“wildtype2”)的痕迹。英国石油(bp) < -bpTrack(data =data.psite,names.rep=names.rep,genes.list=c(“YDR050C”,“YDR062W”,“YDR064W”))为(track.name在names.rep) {轨道。代表< -tracks.bp [[track.name]]跟踪< -GRangesQuantitativeTrack(trackName =粘贴(track.name“英国石油公司”),track.rep (,1),颜色=“绿色”)displayTrack(进口、跟踪)}}

# #本跟踪和测试结果数据(result.pst)数据(data.psite)的痕迹。本< -binTrack(data =result.pst,exon.anno=data.psite美元外显子)为(track.name在的名字(tracks.bin)) {轨道。代表< -tracks.bin [[track.name]]调整(track.rep宽度(track.rep)+1)跟踪< -GRangesQuantitativeTrack(trackName =粘贴(track.name“封存”),track.rep (,1),颜色=“黑色”)displayTrack(进口、跟踪)}轨道。rep2 < -tracks.bin [[1]]sig.bin < -(值(track.rep2),5]< =刺)log10。padj < -- - - - - -log10(值(track.rep2),5])mcols(track.rep2) < -data.frame(log10padj =log10.padj)轨道。rep2 < -track.rep2 [哪一个(sig.bin))跟踪< -GRangesQuantitativeTrack(trackName =“padj -日志10”,track.rep2,颜色=“红色”,trackHeight =40)displayTrack(进口、跟踪)

的第一个输入参数bpTrack (),数据的输出对象psiteMapping ()或RiboDiPA ()函数。如果复制名称names.rep没有指定的列名元数据项将被用作跟踪标签igvR可视化。同样,如果不提供可视化基因的列表,那么所有基因中列出数据覆盖美元将绘制。

这个函数binTrack ()使用的输出对象diffPatterbTest ()或RiboDiPA ()函数的参数数据,值外显子的psiteMapping ()函数输出参数exon.anno。除了核糖体被追踪的,微分模式测试结果也是报道的价值binTrack ()。在图2中,一个碱基对RPF跟踪和被跟踪显示通过igvR。绿条是核糖体的跟踪/ bp,黑条是被跟踪,而红酒吧在重要的垃圾箱(即策划。,调整料位假定值\ \ leq 0.05 \)),\ (- \ log_ {10} \)的调整也假定值绘制。

# #本跟踪和测试结果igv2 < -igvR()setBrowserWindowTitle(igv2“每个外显子的例子核糖体足迹”)setGenome(igv2“saccer3”)数据(result.exon)的痕迹。外显子< -exonTrack(data =result.exon,基因=“泰(卦)D”)为(track.name在的名字(tracks.exon)) {轨道。代表< -tracks.exon [[track.name]]为(tx.name在的名字(track.rep)) {轨道。tx < -tracks.exon [[track.name]] [[tx.name]]跟踪< -GRangesQuantitativeTrack(trackName =粘贴(track.tx [track.name tx.name)1),颜色=track.name)displayTrack(igv2跟踪)}}

高等生物,外显子的垃圾箱统计通过功能测试diffPatternTestExon (),exonTrack ()是适当的函数输出跟踪可视化的目的。它输出列表的列表。每个元素的列表农庄对象代表复制,每个二级列表元素exon-level p区足迹记录计数。

这个论点数据使用的输出对象diffPatternTestExon ()。第二个参数基因需要绘制单个基因的名字,因为不同的基因可能有不同数量的记录。

结论

这就是装饰图案。额外的信息,请查阅参考手册为每个单独的函数,以及相关的论文为这个包方法细节(李等人,2020)。