1．1系统需求

该包要求将所有数据加载到系统内存中。我们所说的“数据”并不是指个人阅读量(这对于全基因组实验来说是很大的)。相反，我们需要的是汇总数据，给出支持甲基化的读取数以及每个位点上的读取总数。专注于人类数据，我们需要处理每个样本最多有2820万个条目的对象(因为人类基因组中大约有2820万个cpg)。这为我们提供了数据对象的上限。

在此基础上，从(Hansen, Timp, et al. 2011)包括平滑的值，占用大约1.2GB的RAM，这意味着可以轻松地使用8GB的RAM进行分析。为了提高速度，该包允许简单的并行处理样品/染色体。这将需要为所使用的每个核心复制多个数据对象，从而大大增加内存使用，甚至可能增加到32GB。这可以通过以速度为代价按顺序处理样本来避免。

在一个64GB节点上，来自(Hansen, Timp, et al. 2011)使用8个核心并行处理大约需要1个小时(总共使用的RAM远远小于64GB)。这并不包括解析来自对齐输出文件的数据。

1．2一些术语

因为不是所有的甲基化都发生在CpG位点，我们尝试使用术语“甲基化位点”来代替CpG。我们用这个术语来指代单碱基甲基化位点。

一些来自DNA甲基化领域的标准术语:差异甲基化区域(DMR)，超甲基化(一种条件/样本的甲基化程度高于另一种情况/样本的甲基化程度)，低甲基化(一种条件/样本的甲基化程度低于另一种情况/样本的甲基化程度)，最后是指单个位点的差异甲基化位置(DMP)。

1.3引用

如果您使用这个包，请引用我们的BSmooth论文(Hansen, Langmead, and Irizarry 2012)．

1．4依赖关系

库(bsseq)

3．1基本操作

类的对象BSseq包含一个农庄目标是基因组位置。这农庄对象可以通过农庄()．若干标准农庄方法直接作用于BSseq对象，例如start ()，结束()，seqnames ()(染色体名称)等。

这些对象还包含phenoData对象获取样本苯酚数据。有用的方法有sampleNames ()，pData ()．

最后，我们有方法，如昏暗的()，ncol ()(列数;样本数)，nrow ()(行数;甲基化位点数)。

对象可以使用两个索引进行子集设置BSseq (i, j)第一个指标为甲基化位点，第二个指标为样品。另一种非常有用的设置对象的方法是使用方法subsetByOverlaps ()．这将选择一组基因组区间内的所有甲基化位点(第一个参数和第二个参数之间有区别，任何一个都可以)BSseq或农庄)．

例子:

head(start(BS.chr22)， n = 4)

## [1] 14430632 14430677 14430687 14430702

head(seqnames(BS.chr22)， n = 4)

## factor-Rle长度为4，运行1次##长度:4 ##值:chr22 ##级别(1):chr22

sampleNames (BS.chr22)

##[1]“r1”“r2”

pData (BS.chr22)

## 2行1列的数据帧## Rep ## <字符> ## r1 replicate1 ## r2 replicate2

暗(BS.chr22)

## [1] 494728 2

BS.chr22 [1:6, 1]

##一个“BSseq”类型的对象，其中## 6个甲基化位点## 1个样本##尚未平滑##所有分析都在内存中

subsetByOverlaps (BS。空空的22，农庄(seqnames = "chr22", ranges = IRanges(start = 1, end = 2*10^7)))

##一个“BSseq”类型的对象，其中## 67082甲基化位点## 2样本##尚未平滑##所有分析都在内存中

3.2数据处理

我们有很多函数来操作一个或多个BSseq对象。

BSseq ()实例化类的对象BSseq．基因组位置被传递进来，或者作为农庄对象(参数gr)或作为染色体和位置向量(参数空空的而且pos)．的参数米而且浸接受矩阵，可以直接给它一个phenoData对象。

M < -矩阵(0:8 3 3)x < -矩阵(1:9,3,3)BStmp < - BSseq(对应= c(“chr1”、“chrX”,“chr1”),pos = 1:3, M = M x = x, sampleNames = c(“A1”、“A2”、“B”))

一个BSseq对象的排序可由orderBSseq ()．这确保了来自单个染色体的数据出现在一个有序的、连续的块中。也有可能指定染色体顺序(这是不太重要的)。平滑函数假设BSseq已经下令了。

农庄(BStmp)

## seqnames ranges strand ##    ## [1] chr1 1 * ## [2] chrX 2 * ## [3] chr1 3 * ## ------- ## seqinfo:来自未指定基因组的2个序列;没有seqlengths

BStmp <- orderBSseq(BStmp, seqOrder = c("chr1"， "chrX")) granges(BStmp))

## seqnames ranges strand ##    ## [1] chr1 1 * ## [2] chr1 3 * ## [3] chrX 2 * ## ------- ## seqinfo:来自未指定基因组的2个序列;没有seqlengths

chrSelectBSseq ()执行通常有用的选择一个或多个染色体的任务，也可以对输出进行排序。以防order = TRUE时，输出按顺序排列seqnames论点。

chrSelectBSseq(BStmp, seqnames = "chr1"， order = TRUE)

##一个“BSseq”类型的对象，其中## 2甲基化位点## 3样本##尚未平滑##所有分析都在内存中

当然，在这种情况下，函数做的很少，因为BS.chr22已经只包含了22号染色体的数据。

结合()结合了两种BSseq对象:返回对象的样本是两个对象样本的并集，甲基化位点是两个甲基化位点的并集。这两个物体不需要测量相同的轨迹(在下面的例子中，BStmp有1号染色体和X染色体的数据)。

BStmp2 <- combine(BStmp, BS.chr22[1:3，])

## seqinfo中的警告。mergexy(x, y):两个组合的对象没有共同的序列级别。(使用## suppressWarnings()来抑制此警告。)mergexy(x, y):两个组合的对象没有共同的序列级别。(使用## suppressWarnings()取消此警告。)

农庄(BStmp2)

## seqnames ranges strand ##    [1] chr1 1 * ## [2] chr1 3 * ## [3] chrX 2 * ## [4] chr22 14430632 * ## [5] chr22 14430677 * ## [6] chr22 14430687 * ## ------- # seqinfo: 3个来自未指定基因组的序列;没有seqlengths

getCoverage (BStmp2)

## A1 A2 B r1 r2 ## [1，] 1 4 7 0 0 ## [2，] 3 6 9 0 0 ## [3，] 25 8 0 0 ## [4，] 0 0 0 18 23 ## [5，] 0 0 0 11 28 ## [6，] 0 0 0 10 25

collapseBSseq类的数列相加，这通常是非常有用的任务BSseq对象。这通常用于分析的开始，其中每个列可能对应一个通道，几个这样的列代表单个生物样品的数据。

(BStmp, group = c("A"， "A"， "B")))

##一个“BSseq”类型的对象，其中## 3甲基化位点## 2样本##尚未平滑##所有分析都在内存中

3．3获得覆盖范围(甲基化)

覆盖率(Cov或M值)由getCoverage ()，使用类型论点:

头(getCoverage (BS。空空的22，类型= "Cov"), n = 4)

# # r1, r2 18 23 # # # # [1] [2] 11 28 25 # # # # 10 [3] [4] 8 21

头(getCoverage (BS。空空的22，类型= "M"), n = 4)

# # r1, r2 20 # # # # 17 [1] [2] 4 20 # # [3] 6 19 # # 2 4 [4]

这将返回一个-可能非常大的-矩阵。方法也可以获得基于区域的覆盖地区函数的参数。这个论证要么是adata.frame(列空空的，开始而且结束)或农庄对象。我们举个例子

region <- GRanges(seqnames = c("chr22"， "chr22")， ranges = IRanges(start = 1.5 * 10^7 + c(0,200000)， width = 1000))chr22, regions = regions, what = "perRegionTotal")

## r1 r2 ## [1，] 30 38 ## [2，] NA NA

当什么是perRegionTotal返回值是每个区域的总覆盖率(注意没有覆盖率的区域返回NA)．同样的,perRegionAverage产生该区域的平均覆盖率。然而，获得实际值通常是有用的，比如

getCoverage (BS。空空的22，地区= regions, what = "perBase")

# # # # ([1]) [1] [2] 30 # # # # 21 [1] [2] 2 8 # # [3] 7 0 # # # # [[2]] # # NULL

这是默认行为，它返回一个列表，其中每个元素对应一个区域。请注意，没有覆盖的地区将得到a零．

甲基化估计可以用相同的方法获得，使用函数getMeth ()．如果类型设置为生该函数返回简单的单位点甲基化估计值(即M/Cov)。为了得到平滑估计，BSseq对象需要使用Bsmooth平滑，并且类型设置为光滑的(默认)。的getCoverage (0，getMeth ()有一个地区和一个什么论点。为getMeth ()的什么参数可以是perBase或perRegion(后者实际上是每个区域的平均甲基化)。此外，可以使用考虑低覆盖率位点以及甲基化百分比可能接近0或1的位点的方法计算置信区间(Agresti和Coull 1998)．目前，无法计算区域一级汇总估计数的置信区间。例子

getMeth (BS。空空的22，地区，类型= "raw")

# # # #([1])[1][2] # #(1) 0.1904762 - 0.1666667 # #(2) 1.0000000 - 0.7500000 # # 0.1428571[3]南# # # # # # [[2]]NULL

getMeth (BS。空空的22，地区[2], type = "raw", what = "perBase")

## [[1]] ## null

4．1BSmooth对齐套件的对齐输出

从BSmooth对齐套件中读取输出文件(汇总证据)非常简单，使用read.bsmooth ()．这个函数以一些目录作为参数，这些目录通常对应于样本，并带有对齐输出。有时，人们可能只想读取某些染色体，这可以通过seqnames论点。的默认值qualityCutoff = 20确保我们不使用基本质量严格低于20的甲基化证据(因为我们可能不确定读取是否真的支持甲基化)。这个函数read.bsmooth ()允许gzip和非gzip的输入文件。读取经过gzip压缩的文件速度更快，因此我们建议在对齐后进行gzip压缩。

在开发BSmooth的过程中，我们尝试了许多不同的输出格式。可以读取这些遗留格式read.umtab ()而且read.umtab2 ()．

4.2来自其他对齐器的对齐输出

我们感兴趣的是向包中添加额外的解析器;如果您最喜欢的对齐软件不受支持，请随时联系。

总的来说，我们需要总结甲基化证据。简而言之，对于每个甲基化位点，我们需要知道有多少reads覆盖了该位点，以及这些reads中有多少支持甲基化。

例如，考虑Lister数据。网上公布的文件看起来

>头mc_imr90_r1_22装配位置绞线类mc h 22 14430632 + CG 9 10 22 14430633 - CG 88 22 14430677 + CG 11 22 14430678 - CG 3 10 22 14430688 - CG 6 10 22 14430703 - CG 2 8 22 14431244 + CG 5 10 22 14431245 - CG 5 11

在这些文件中，证据是按链分割的。通常最简单的方法是一次读取一个样本，实例化一个BSseq对象，然后使用结合()而且collapseBSseq ()来组合样本，因为这些函数处理的对象具有不同的cpg集。在Lister数据中，注意位置是“C”的位置，所以基本上，如果您想结合来自两条链的证据，“-”链上的cpg需要从它们的位置减去1。一个完整的脚本显示如何使用这些文件创建BS.chr22可在本月/脚本/ \ _BS.chr22.R在bsseq包中。该文件的路径可以通过

系统。文件(“脚本”、“get_BS.chr22。R"， package = "bsseq")