1简介

的conumee包提供执行的工具有限公司py -ν使用Illumina 450k或EPIC DNA进行成员数变异(CNV)分析我thylation数组。虽然这些阵列的主要目的是检测全基因组DNA甲基化水平[1]，它还可以用于提取有关拷贝数改变的有用信息，例如在临床癌症样本中。Sturm等人在2012年首次描述了这种方法[２]．遵循类似策略的其他工具包括冠军[3]而且CopyNumber450k(现在弃用)。

CNV分析采用两步方法进行。首先，每个CpG的“甲基化”和“非甲基化”通道的组合强度值使用一组正常对照进行归一化(即使用不显示任何拷贝数变化的平坦基因组)。该步骤用于校正探针和样品偏差(例如，由gc含量、I/II型差异或技术可变性引起的偏差)。其次，相邻的探测以一种混合方法组合，从而得到最小大小和最小探测数量的容器。这一步是必要的，以减少剩余的技术可变性，并实现有意义的分割结果。

的conumee软件包已编写与常用的Bioconductor软件包无缝集成。方法加载甲基化数组数据minfi包[4]．中实现的循环二进制分割(CBS)算法进行分割DNAcopy包［5］．每个样品的处理时间通常小于一分钟。

最后,conumee软件包还提供了一套绘图方法来创建出版级的全基因组、选定的染色体或先前定义的感兴趣区域的CNV图。也支持在其他工具(例如IGV浏览器)或下游处理(例如使用GISTIC)中编写基于文本的输出文件以实现可视化。

2加载数据

建议输入格式为Mset对象从原始IDAT文件生成minfi包中。根据分析工作流，这些对象可能已经可用。一个用于测试的450k数据集的好例子conumee包可从TCGA下载(971.6 MB):

https://tcga-data.nci.nih.gov/tcgafiles/ftp_auth/distro_ftpusers/anonymous/tumor/brca/cgcc/jhu-usc.edu/humanmethylation450/methylation/jhu-usc.edu_BRCA.HumanMethylation450.Level_1.8.8.0.tar.gz

更新2016年10月:TCGA数据门户不再运作。TCGA DNA甲基化数据现在可以从NCI GDC遗留档案下载:https://gdc-portal.nci.nih.gov/legacy-archive

该数据集包括42个原发性乳腺癌样本、2个乳腺癌细胞系和16个对照样本。请确保解压存档文件。属性只下载了两个说明性示例read.450k.url方法。

library("minfi") library("conumee") #RGsetTCGA <- read.450k。exp(base = "~/conumee_analysis/jhu-usc. edu_brca . humanmethylation450 . level_name .8.8.0") #调整路径RGsetTCGA <- read.450k.url() #使用缺省参数为插图示例MsetTCGA <- preprocessIllumina(RGsetTCGA) MsetTCGA ##类:MethylSet ## dim: 485512 2 ##元数据(0):## assays(2): Meth Unmeth ## rownames(485512): cg00050873 cg00212031…ch. 22.47579720r# # ch. 22.48274842r# # rowData names(0): ## colnames(2): 6042324037_R05C02 6042324037_R06C01 ## colData names(0): ## Annotation ##数组:IlluminaHumanMethylation450k ## Annotation: ilmn12。方法:Illumina, bg. hg19;有限公司rrect = TRUE, normalize = controls, reference = 1 ## minfi version: 1.42.0 ## Manifest version: 0.4.0

或者，您可以使用minfiData示例数据集，包括3个癌症样本和3个正常对照。

library("minfiData") data(MsetEx) MsetEx ## class: MethylSet ## dim: 485512 6 ## metadata(0): ## assays(2): Meth Unmeth ## rownames(485512): cg00050873 cg00212031…ch. 22.47579720r# # ch. 22.48274842r# # rowData names(0): ## colnames(6): 5723646052_R02C02 5723646052_R04C01…5723646053_R05C02 ## 5723646053_R06C02 ## colData names(13): Sample_Name Sample_Well…注释:IlluminaHumanMethylation450k注释:ilmn12。hg19 ##预处理##方法:Raw(没有归一化或bg校正)## minfi版本:1.21.2 ## Manifest版本:0.4.0

的CopyNumber450kPackage提供了一个包含52个控制样本的大型数据集，可用于归一化。

2017年4月更新CopyNumber450k而且CopyNumber450kData软件包现在已被弃用。我们将使用3个正常的控制minfiData现在打包。使用更大的对照样本集会得到更好的结果。

# library("CopyNumber450kData") # data(RGcontrolSetEx) # MsetControls <- preprocessIllumina(RGcontrolSetEx)

如果原始IDAT文件不可用，也可以通过导入基于文本的输入文件来提供数据，例如由GenomeStudio生成的文件或从GEO存储库下载的文件。后面会给出更多细节。

3.创建注释对象

方法生成的注释对象首先进行CNV分析CNV.create_anno函数，是必需的。该对象保存的信息只需要生成一次，与处理的样本数量无关。

参数bin_minprobes而且bin_minsize定义每个bin的最小探测数量和最小bin大小(为450k数据优化的默认值分别为15和50000)。论点exclude_regions定义要排除的区域(例如，多态区域，在数据(exclude_regions))．请参阅CNV.create_anno ?欲知详情。

论点detail_regions定义要详细检查的区域(例如，专用的细节图或文本输出，见下文)。例如，细节区域可以包含已知的癌基因或肿瘤抑制基因。这些区域应该以BED文件的路径或GRanges对象的形式提供(在数据(detail_regions))．开始和停止坐标表示详细分析探测的区域。详细图的绘制范围在GRanges对象值(或7^th和8^th列在BED文件)。

数据(exclude_regions)数据(detail_regions)头(detail_regions, n = 2) # #农庄对象2和5元数据列:# # seqnames范围链|名称厚# # < Rle > < IRanges > < Rle > | <人物> < IRanges > # # [1] chr11 69453874 - 69453874 + | CCND1 68961558 - 68961558 # # [2] chr19 30300902 - 30300902 + | CCNE1 29808059 - 29808059 # #得分probes_gene probes_promoter # # <整数> <整数> <整数> # # [1]70 38 32 # # 16 10 6 [2]  ## ------- ## seqinfo: 11因基因组序列;no seqlengthanno <- CNV。create_anno (array_type = 450 k, exclude_regions = exclude_regions detail_regions = detail_regions)使用从UCSC基因组注释# # # # 450 # # - 470870 k注释探针使用# #从分析进口地区排除# #进口区域详细分析创建垃圾箱# # # # # # - 53891箱创建合并垃圾箱# # - 15820箱剩余庵野# # # #创建CNV注释对象:2022年四月26日16:24:58 # # @genome:染色体22 # # @gap: 313 # # @probes区域:470870探针## @排除:3个区域(重叠570探针)## @细节:20个区域(重叠768探针)## @箱子:15820箱子(最小/平均/最大大小:50/168.5/5000kb，探针:15/29.7/478)

4结合强度值

“甲基化”和“非甲基化”通道的强度值使用CNV.load函数。输入可以是Mset对象(推荐使用，请参见上文)，或者data.frame或矩阵包含由GenomeStudio生成或从GEO下载的强度的对象(使用例如导入)。read.table，对于大多数表应在无需重新格式化的情况下工作，请参阅CNV.load ?有关详情)。

TCGA样本id由conumee包sampleNames(MsetTCGA) <- tcgaBRCA.sentrix2name[sampleNames(MsetTCGA)] TCGA提供。data <- CNV.load(MsetTCGA) tcga。有限公司ntrols <- grep("-11A-", names(tcga.data)) names(tcga.data) ## [1] "TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05" "TCGA-AR-A1AY-01A-21D-A12R-05" tcga.data ## CNV data object ## created : ## @intensity : available (2 samples, 485512 probes) minfi.data <- CNV.load(MsetEx) minfi.controls <- pData(MsetEx)$status == "normal" # controls.data <- CNV.load(MsetControls)

5执行CNV分析

CNV分析主要分为四个部分:

• 首先,CNV.fit用于通过多元线性回归将单个查询样本归一化为一组控制样本。为了获得最佳结果，在同一实验中使用了匹配的正常组织对照样本(它们可能具有相同的技术偏差)。从本质上讲，这种回归分析产生的控制样本的线性组合与查询样本的强度最接近。随后，计算查询样本与控制样本组合的探测强度的log2比，并用于进一步分析。更多细节见出版物。
• 其次,CNV.bin用于在预定义的基因组箱中组合探针。以前使用CNV.create_anno．转移强度值以使所有箱子的中位数绝对偏差最小化至零，以确定副本数中性状态。
  
• 第三,CNV.detail用于详细分析详细区域。此步骤是可选的，但如果需要在图和文本文件中输出详细区域，则必须执行此步骤。使用定义详细区域CNV.create_anno．
• 最后,CNV.segment用于将基因组分割成具有相同拷贝数状态的区域。类的包装器中央社，段，segments.summary而且segments.p的功能DNAcopy包中。默认参数针对450k数据进行了优化，但可以更改。看到CNV.segment ?欲知详情。

x <- CNV.fit(minfi. fit)数据(“GroupB_1”),minfi.data [minfi。有限公司ntrols], anno) # y <- CNV.fit(tcga.data["TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05"], controls.data, anno) # CopyNumber450kData package is deprecated # z <- CNV.fit(tcga.data["TCGA-AR-A1AY-01A-21D-A12R-05"], controls.data, anno) y <- CNV.fit(tcga.data["TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05"], minfi.data[minfi.controls], anno) # minfiData control samples z <- CNV.fit(tcga.data["TCGA-AR-A1AY-01A-21D-A12R-05"], minfi.data[minfi.controls], anno) x <- CNV.bin(x) x <- CNV.detail(x) x <- CNV.segment(x) y <- CNV.segment(CNV.detail(CNV.bin(y))) z <- CNV.segment(CNV.detail(CNV.bin(z))) x ## CNV analysis object ## created : Tue Apr 26 16:25:26 2022 ## @name : GroupB_1 ## @anno : 22 chromosomes, 470870 probes, 15820 bins ## @fit : available (noise: 0.237) ## @bin : available (shift: -0.018) ## @detail : available (20 regions) ## @seg : available (48 segments)

6输出图形和文本文件

的conumee包支持两种类型的图:

• 的CNV.genomeplot方法生成完整基因组或一条或多条染色体的图谱。每个箱子的强度值用彩色点表示。分段显示为蓝线。看到CNV.genomeplot ?欲知详情。
• 的CNV.detailplot方法生成单个细节区域的图，如CNV.create_anno．每个探针的强度值用彩色十字表示。箱子显示为蓝色线。CNV.detailplot_wrap是一个包装器函数，它生成所有详细区域的单个图形。

属性生成文本输出CNV.write方法。参数什么指定是否应该返回" probes "， " bins "， " detail "或" segments "。如果参数文件，则输出被写入文件，否则data.frame返回。看到CNV.write ?欲知详情。

#pdf("~/conumee_analysis/CNVplots.pdf"， height = 9, width = 18) CNV.genomeplot(x) CNV.genomeplot(y) CNV.genomeplot(y) CNV.genomeplot(x)genomeplot(y, chr = "chr6") CNV.genomeplot(z)genomeplot(z, chr = "chr10") CNV.detailplot(z, name = "PTEN") CNV.detailplot_wrap(z) #dev.off() head(CNV.;write(y, what = "segments")， n = 5) ## ID chrom loc。疯狂的开始。1 TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05 chr1 635684 88100000 726 29.32946 ## 2 TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05 chr1 119000000 249195311 704 NA ## 4 TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05 chr10 105000 135462374 840 NA ## 5 TCGA-AR-A1AU-01A-11D-A12R-05 chr11 130000 50516927 326 22.74454 ## pval seg意味着凹陷。我dian ## 1 2.906752e-186 0.009 0.015 ## 2 1.991610e-224 -0.264 -0.254 ## 3 NA 0.097 0.098 ## 4 NA -0.023 -0.021 ## 5 5.343554e-112 0.141 0.136 #CNV.write(y, what = "segments", file = "~/conumee_analysis/TCGA-AR-A1AU.CNVsegments.seg") # adjust path #CNV.write(y, what = "bins", file = "~/conumee_analysis/TCGA-AR-A1AU.CNVbins.igv") #CNV.write(y, what = "detail", file = "~/conumee_analysis/TCGA-AR-A1AU.CNVdetail.txt") #CNV.write(y, what = "probes", file = "~/conumee_analysis/TCGA-AR-A1AU.CNVprobes.igv")

7联系与引用

关于错误报告，评论和功能要求，请写信给conumee@hovestadt.bio．

当使用conumee在您的工作中，请引用为:

引用(“conumee”)## ##在出版物中引用包装“conumee”使用:## ## Hovestadt V, Zapatka M(2017)。“conumee:使用Illumina DNA甲基化阵列进行增强拷贝数变异分析”，R软件包1.9.0版。< URL: //www.andersvercelli.com/packages/conumee/ >。## ## LaTeX用户的BibTeX条目是## ## @Manual{， ## title = {conumee:使用Illumina DNA甲基化##阵列进行增强拷贝数变异分析}，##作者= {Volker Hovestadt和Marc Zapatka}， ##地址={德国海德堡德国癌症研究中心(DKFZ)分子遗传学部门}，## note = {R包版本1.9.0}，## url = {//www.andersvercelli.com/packages/conumee/}， ##}

8会话信息

sessionInfo() ## R version 4.2.0 RC (2022-04-19 r82224) ##平台:x86_64-pc-linux-gnu(64位)##运行在:Ubuntu 20.04.4 LTS ## ##矩阵产品:默认## BLAS: /home/biocbuild/bbs-3.15-bioc/R/lib/libRblas。/home/biocbuild/bbs-3.15-bioc/R/lib/libRlapack。所以## ## locale: ## [1] LC_CTYPE=en_US。UTF-8 LC_NUMERIC= c# # [3] LC_TIME=en_GB LC_COLLATE= c# # [5] LC_MONETARY=en_US。utf - 8 LC_MESSAGES = en_US。UTF-8 ## [7] LC_PAPER=en_US。UTF-8 LC_NAME= c# # [9] LC_ADDRESS=C lc_phone = c# # [11] LC_MEASUREMENT=en_US。UTF-8 LC_IDENTIFICATION=C ## ##附加的基本包:##[1]并行stats4统计图形grDevices utils数据集##[8]方法基础## ##其他附加包:# # # # [1] minfiData_0.41.0 [2] conumee_1.30.0 # # [3] IlluminaHumanMethylationEPICmanifest_0.3.0 # # [4] IlluminaHumanMethylationEPICanno.ilm10b2.hg19_0.6.0 # # [5] IlluminaHumanMethylation450kmanifest_0.4.0 # # [6] IlluminaHumanMethylation450kanno.ilmn12.hg19_0.6.1 # # [7] minfi_1.42.0 # # [8] bumphunter_1.38.0 # # [9] locfit_1.5 - 9.5 # # [10] iterators_1.0.14 # # [11] foreach_1.5.2 # # [12] Biostrings_2.64.0 # # [13] XVector_0.36.0 # # [14] SummarizedExperiment_1.26.0 # # [15] Biobase_2.56.0 # # [16][22] BiocGenerics_0.42.0 ## [23] BiocStyle_2.24.0 ## ##通过命名空间加载(并且没有附加):# # # # [1] BiocFileCache_2.4.0 plyr_1.8.7 [3] splines_4.2.0 BiocParallel_1.30.0 # # [5] digest_0.6.29 htmltools_0.5.2 # # [7] magick_2.7.3 fansi_1.0.3 # # [9] magrittr_2.0.3 memoise_2.0.1 # # [11] tzdb_0.3.0 limma_3.52.0 # # [13] readr_2.1.2 annotate_1.74.0 # # [15] askpass_1.1 siggenes_1.70.0 # # [17] prettyunits_1.1.1 blob_1.2.3 # # [19] rappdirs_0.3.3 xfun_0.30 # # [21] dplyr_1.0.8 crayon_1.5.1 # # [23] rcurl_1.98 - 1.6 jsonlite_1.8.0 # # [25] genefilter_1.78.0 GEOquery_2.64.0 # # [27] survival_3.3-1glue_1.6.2 # # [29] zlibbioc_1.42.0 DelayedArray_0.22.0 # # [31] Rhdf5lib_1.18.0 HDF5Array_1.24.0 # # [33] DBI_1.1.2 rngtools_1.5.2 # # [35] Rcpp_1.0.8.3 xtable_1.8-4 # # [37] progress_1.2.2 bit_4.0.4 # # [39] mclust_5.4.9 preprocessCore_1.58.0 # # [41] httr_1.4.2 RColorBrewer_1.1-3 # # [43] ellipsis_0.3.2 pkgconfig_2.0.3 # # [45] reshape_0.8.9 xml_3.99 - 0.9 # # [47] sass_0.4.1 dbplyr_2.1.1 # # [49] utf8_1.2.2 DNAcopy_1.70.0 # # [51] tidyselect_1.1.2 rlang_1.0.2 # # [53] AnnotationDbi_1.58.0 tools_4.2.0 # #[55] cachem_1.0.6 cli_3.3.0 ## [57] generics_0.1.2 RSQLite_2.2.12 ## [59] evaluate_0.15 string_1 .4.0 ## [61] fastmap_1.1.0 yaml_2.3.5 ## [63] knitr_1.38 bit64_4.0.5 ## [65] beanplot_1.3.1 scrime_1.3.5 ## [67] purrr_0.3.4 KEGGREST_1.36.0 ## [69] nlme_1 .3.1 -157 doRNG_1.8.2 ## [71] sparseMatrixStats_1.8.0 nor1mix_1. 1.3-0 ## [73] xml2_1.3.3 biomaRt_2.52.0 ## [75] compiler_4.2.0 filelock_1.0.2 ## [77] curl_4.3.2 png_0.1-7 ## [81] stringi_1.7.6 highr_0.9 ## [83] GenomicFeatures_1.48.0 lattice_0.20-45 ## [85] Matrix_1.4-1 multtest_2.52.0 ## [87] vctrs_0.4.1 pillar_1.7.0 ## [89] lifecycle_1.0.1 rhdf5filters_1.8.0 ## [91] BiocManager_1.30.17 jquerylib_0.1.4 ## [93] data.table_1.14.2 bitops_1.0-7 ## [95] rtracklayer_1.56.0 R6_2.5.1 ## [97] BiocIO_1.6.0 bookdown_0.26 ## [99] codetools_0.2-18 MASS_7.3-57 ## [101] assertthat_0.2.1 rhdf5_2.40.0 ## [103] openssl_2.0.0 rjson_0.2.21 ## [105] GenomicAlignments_1.32.0 Rsamtools_2.12.0 ## [107] GenomeInfoDbData_1.2.8 hms_1.1.1 ## [109] quadprog_1.5-8 grid_4.2.0 ## [111] tidyr_1.2.0 base64_2.0 ## [113] rmarkdown_2.14 DelayedMatrixStats_1.18.0 ## [115] illuminaio_0.38.0 restfulr_0.0.13