2.1总结

的diffcyt方法包括两个主要组成部分:(i)高分辨率聚类和(ii)从转录组学改编的经验贝叶斯缓和测试。

我们使用高分辨率聚类来定义代表细胞群体的大量小聚类。默认情况下，我们使用FlowSOM聚类算法(Van Gassen et al.， 2015)生成高分辨率聚类，因为我们之前表明，该聚类算法具有出色的聚类性能和快速的高维细胞术数据运行时间(Weber和Robinson, 2016)。然而，原则上，也可以使用其他可以生成高分辨率集群的算法。

对于差异分析，我们使用的方法来自刨边机包装(Robinson et al.， 2010;McCarthy et al.， 2012);limmapackage (Ritchie et al.， 2015)，以及轰方法(Law et al.， 2014)。这些方法在转录组学领域得到了广泛的应用，在这里也适用于分析高维细胞术数据。此外，我们还提供了基于广义线性混合模型(glmm)、线性混合模型(lmm)和线性模型(lm)的替代方法，这些方法最初由Nowicka等人(2017)实现。

2.2差丰度(DA)和差态(DS)

的diffcyt方法可用于测试细胞群体的差异丰度(DA)和细胞群体内的差异状态(DS)。

为此，该方法要求将一组蛋白质标记分为“细胞类型”和“细胞状态”标记。细胞类型标记用于定义代表细胞群体的集群，对其进行差异丰度测试;每个集群的中位数细胞状态标记信号用于测试群体内的差异状态。

细胞类型和细胞状态标记的概念分裂促进了生物学的可解释性，因为它允许结果与已知的细胞类型或感兴趣的群体联系起来。

2.3灵活的实验设计和对比

的diffcyt模型设置使用户能够指定灵活的实验设计，包括批量效果，配对设计和连续协变量。线性对比用于指定感兴趣的比较。

2.4更多的细节

本文对统计方法进行了完整的描述，并与现有方法进行了比较diffcyt框架(Weber等人，2019)。

4.1数据集

对于本插图中的示例工作流，我们使用Bodenmiller_BCR_XL数据集，最初来自Bodenmiller等人(2012)。

这是一个公开的细胞计数(CyTOF)数据集，由健康外周血单个核细胞(PBMCs)成对样本组成，其中每对样本中的一个样本用B细胞受体/ Fc受体交联剂(BCR-XL)刺激。数据集包含16个样本(8个成对样本);共172,791个单元;共有24个蛋白标记。这些标记包括10个“细胞类型”标记(可用于定义细胞群体或细胞簇)和14个“细胞状态”或信号标记。

该数据集包含已知的几种细胞群体(尤其是B细胞)中几种信号标记的强差异表达信号。特别是，观察到的最强差异信号是B细胞中磷酸化的S6 (pS6)信号标记(见Nowicka et al.， 2017，图29)。在此工作流程中，我们将展示如何执行差分测试以恢复此信号。

4.2从“HDCytoData”包加载数据

的Bodenmiller_BCR_XL数据集可以方便地从HDCytoDataBioconductor“实验数据”包。它可以被装入任何一种SummarizedExperiment或flowSet格式。在这里，我们用theflowSet格式，这是标准的流式细胞术社区。对于一些可选的分析管道SummarizedExperiment格式可能更方便。有关详细信息，请参阅此数据集的帮助文件HDCytoData包(库(HDCytoData)；Bodenmiller_BCR_XL ?)。

suppressPackageStartupMessages(库(HDCytoData))

## snapshotDate(): 2022-04-19

#下载并加载'Bodenmiller_BCR_XL'数据集在'flowSet'格式d_flowSet <- Bodenmiller_BCR_XL_flowSet()

查看HDCytoData和browsevignetttes ('HDCytoData')的文档

##从缓存加载

updateObjectFromSlots(object，…， verbose = verbose):删除## slot(s)'colnames' from object = 'flowSet'

suppressPackageStartupMessages(library(flowCore)) #检查数据格式d_flowSet

带有16个实验的flowSet。## ##列名称(39):Time Cell_length…sample_id population_id

#示例名称pData(d_flowSet)

## name ## # bcr - xlfcs PBMC8_30min_patient1_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient1_Reference。fcs PBMC8_30min_patient1_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient2_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient2_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient2_Reference。fcs PBMC8_30min_patient2_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient3_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient3_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient3_Reference。fcs PBMC8_30min_patient3_Reference。fcs ## # PBMC8_30min_patient4_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient4_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient4_Reference。fcs PBMC8_30min_patient4_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient5_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient5_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient5_Reference。fcs PBMC8_30min_patient5_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient6_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient6_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient6_Reference。fcs PBMC8_30min_patient6_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient7_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient7_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient7_Reference。fcs PBMC8_30min_patient7_Reference。fcs ## PBMC8_30min_patient8_BCR-XL。fcs PBMC8_30min_patient8_BCR-XL。fcs ## PBMC8_30min_patient8_Reference。fcs PBMC8_30min_patient8_Reference.fcs

#单元数fsApply(d_flowSet, nrow)

## [，1] ## PBMC8_30min_patient1_BCR-XLfcs 2838 ## PBMC8_30min_patient1_Reference。fcs 2739 ## PBMC8_30min_patient2_BCR-XL。fcs 16675 ## PBMC8_30min_patient2_Reference。fcs 16725 ## PBMC8_30min_patient3_BCR-XL。fcs 12252 ## PBMC8_30min_patient3_Reference。fcs 9434 ## PBMC8_30min_patient4_BCR-XL。fcs 8990 ## PBMC8_30min_patient4_Reference。fcs 6906 ## PBMC8_30min_patient5_BCR-XL。fcs 8543 ## PBMC8_30min_patient5_Reference。fcs 11962 ## PBMC8_30min_patient6_BCR-XL。fcs 8622 ## PBMC8_30min_patient6_Reference。fcs 11038 ## PBMC8_30min_patient7_BCR-XL。fcs 14770 ## PBMC8_30min_patient7_Reference。fcs 15974 ## PBMC8_30min_patient8_BCR-XL。fcs 11653 ## PBMC8_30min_patient8_Reference。fcs 13670

# dimensions dim(exps (d_flowSet[[1]]))

## [1] 2838 39

# expression values (d_flowSet[[1]])[1:6, 1:5]

##时间Cell_length CD3(110:114)Dd CD45(In115)Dd BC1(La139)Dd ## [1，] 33073 30 120.823265 454.6009 576.8983 ## [2，] 36963 35 135.106171 624.6824 564.6299 ## [3，] 37892 30 -1.664619 6077.2668 ## [4，] 41345 58 115.290245 820.7125 6088.5967 ## [5，] 42475 35 14.373802 326.6405 4606.6929 ## [6，] 44620 31 37.737877 557.0137 4854.1519

4.3或者:加载数据从'。fcs的文件

或者，您也可以直接从一组.fcs文件使用以下代码。注意，我们使用了选项transformation = FALSE和truncate_max_range = FALSE控件执行的自动转换和数据截断flowCore包中。的自动选项flowCore包为流式细胞术而不是质量细胞术数据优化，因此这些选项应禁用用于质量细胞术数据。)

#或者:加载数据从'。Fcs的文件<- list。文件(path = "path/to/ Files "， pattern = "\\。fcs$"， full.names = TRUE) d_flowSet <- read。flowSet（files, transformation = FALSE, truncate_max_range = FALSE )

4.4设置元数据

接下来，我们设置所需的“元数据”diffcyt管道。元数据描述了本实验或数据集的样品和蛋白质标记。元数据应该保存在两个数据帧中:experiment_info和marker_info。

的experiment_info数据框包含关于每个样本的信息，包括样本id、组id、批id或患者id(如果相关)、连续协变量(如年龄(如果相关))以及任何其他因素或协变量。在许多实验中，感兴趣的主要比较将是群体id因素(也可称为条件或治疗;例如患病vs.健康，治疗vs.未治疗)。

的marker_info数据框包含有关蛋白质标记的信息，包括通道名称、标记名称和每个标记的类(细胞类型或细胞状态)。

下面，我们手动创建这些数据框架。根据您的实验，将元数据保存在电子表格中可能更方便. csv格式，然后可以使用read.csv。

在此应特别注意确保所有样品和标记的顺序正确。在下面的代码中，我们显示最终的数据帧来检查它们。

#元数据:实验信息#检查样本订单文件名<- as.character(pData(d_flowSet)$name) #样本信息sample_id <- gsub(“^PBMC8_30min_”，“”，gsub(“\\ \。fcs”、“美元”,文件名)group_id < -因子(gsub(“^病人[0 - 9 ]+_", "", sample_id),水平= c(“参考”、“BCR-XL”))patient_id < -因子(gsub(“_。*$"， ""， sample_id))) experiment_info <- data.frame(group_id, patient_id, sample_id, stringsAsFactors = FALSE)

# # 1 # # group_id patient_id sample_id BCR-XL patient1 patient1_BCR-XL # # 2参考patient1 patient1_Reference # # 3 BCR-XL受事2 patient2_BCR-XL # # 4参考受事2 patient2_Reference # # 5 BCR-XL patient3 patient3_BCR-XL # # 6参考patient3 patient3_Reference # # 7 BCR-XL patient4 patient4_BCR-XL # # 8引用patient4 patient4_Reference # # 9 BCR-XL patient5 patient5_BCR-XL # # 10参考patient5 patient5_Reference # # 11 BCR-XL patient6 patient6_BCR-XL patient6 # # 12参考BCR-XL patient7_BCR-XL ## 14参考文献patient7_Reference ## 15 BCR-XL patient8_BCR-XL ## 16参考文献patient8_patient8_reference ## 13 BCR-XL patient7_BCR-XL ## 14

#元数据:标记信息#来源:Bruggner et al.(2014)，表1 #所有标记、谱系标记和功能标记的列索引cols_marker <- c(3:4, 7:9, 11:19, 21:22, 24:26, 28:31, 33) cols_lineage <- c(3:4, 9,11,12,14,21,29,31,33) cols_func <- setdiff(cols_markers, cols_lineage) #通道和标记名称channel_name <- colnames(d_flowSet) marker_name <- gsub("\\(*$"， ""， channel_name) #标记类#注意:使用'细胞类型'的血统标记和'细胞状态'的功能标记marker_class <- rep("none"， ncol(d_flowSet[[1]])) marker_class[cols_lineage] <- "type" marker_class[cols_func] <- "state" marker_class <- factor(marker_class, levels = c("type"， "state"， "none")) marker_info <- data.frame(channel_name, marker_name, marker_class, stringsAsFactors = FALSE) marker_info

# # 1 # # channel_name marker_name marker_class时间时间没有# # 2 Cell_length Cell_length没有# # 3 CD3 (110:114) Dd CD3类型# # 4 CD45 (In115) Dd CD45类型群体BC1 (La139) # # 5 Dd群体BC1没有# # 6 BC2 (Pr141) Dd BC2没有# # 7 pNFkB (Nd142) Dd pNFkB状态# # 8 pp38 (Nd144) Dd pp38状态# # 9 CD4 (Nd145) Dd CD4类型# # 10 BC3 (Nd146) Dd BC3没有# # 11 CD20 (Sm147) Dd CD20类型# # 12 CD33 (Nd148) Dd CD33类型# # 13 pStat5 (Nd150) Dd pStat5状态# # 14 CD123 (Eu151) Dd CD123类型# # 15 pAkt (Sm152) Dd pAkt状态# # 16pStat1 (Eu153) Dd pStat1状态# # 17 pSHP2 (Sm154) Dd pSHP2状态# # 18 pZap70 (Gd156) Dd pZap70状态# # 19 pStat3 (Gd158) Dd pStat3状态# # 20 BC4 (Tb159) Dd BC4没有# # 21 CD14 (Gd160) Dd CD14类型# # 22 pSlp76 (Dy164) Dd pSlp76状态# # 23 BC5 (Ho165) Dd BC5没有# # 24 pBtk (Er166) Dd pBtk状态# # 25 pPlcg2 (Er167) Dd pPlcg2状态# # 26活跃(Er168) Dd活跃状态# # 27 BC6 (Tm169) Dd BC6没有# # 28平台(Er170) Dd平台状态# # 29 IgM (Yb171) Dd IgM类型30魔法石第六章(Yb172) # # # # 31 HLA-DR Dd魔法石第六章状态(Yb174) Dd HLA-DR类型## 32 BC7(Lu175)Dd BC7 none ## 33 CD7(Yb176)Dd CD7 type ## 34 DNA-1(Ir191)Dd DNA-1 none ## 35 DNA-2(Ir193)Dd DNA-2 none ## 36 group_id group_id none ## 37 patient_id patient_id none ## 38 sample_id sample_id none ## 39 population_id population_id none

4.5建立设计矩阵(或模型公式)

要计算微分测试diffcyt功能需要一个描述实验设计的设计矩阵(或模型公式)。(设计矩阵和模型公式的选择取决于所采用的差分试验方法;有关详细信息，请参阅帮助文件中的不同测试方法。)

可以使用该函数以所需的格式创建设计矩阵createDesignMatrix ()。方法需要设计矩阵diffcyt-DA-edgeR(DA测试的默认方法)，diffcyt-DA-voom,diffcyt-DS-limma(DS测试的默认方法)。

类似地，可以使用该函数创建模型公式createFormula ()。替代方法需要模型公式diffcyt-DA-GLMM(DA测试)和diffcyt-DS-LMM(DS测试)。

在这两种情况下，灵活的实验设计是可能的，包括阻塞(例如批处理效应或配对设计)和连续协变量。看到createDesignMatrix ?或createFormula ?有关更多细节和示例。

注意，在这里显示的示例中，我们包含了group_id和patient_id在设计矩阵中:group_id对于微分检验，因子是感兴趣的吗patient_id之所以包含，是因为该数据集包含来自每个患者的成对样本。(对于未配对的数据集，只有group_id将包括在内。)

注意:选择包含组id和患者id的列(对于# unpaired数据集，只包含组id) design <- createDesignMatrix(experiment_info, cols_design = c("group_id"， "patient_id"))

4.6建立对比矩阵

为了计算微分检验，还需要一个对比矩阵。对比矩阵指定感兴趣的比较，即在零假设下假设为零的模型参数的组合。

可以使用该函数以所需的格式创建对比矩阵createContrast ()。这个函数只需要一个参数:一个定义对比度的数字向量。在许多情况下，这将只是一个0向量和一个等于1的单条目，它将测试单个参数是否等于0。如果使用了设计矩阵，则条目对应于设计矩阵的列;如果使用了模型公式，则条目对应于固定效应项的水平。

看到createContrast ?了解更多详情。

这里，我们感兴趣的是比较条件BCR-XL反对参考，即比较BCR-XL水平对着参考水平仪group_id考虑因素experiment_info数据帧。这对应于测试是否为列系数group_idBCR-XL在设计矩阵中设计等于0。这种对比可以指定如下。(注意每个系数只有一个值，包括截距项;最终对比矩阵中的行对应于设计矩阵中的列。)

#创建对比矩阵反差<- createContrast(c(0,1, rep(0,7)))) # check nrow(反差)== ncol(design)

## [1] true

Data.frame (parameters = colnames(design)， contrast)

##参数对比## 1(截距)0 ## 2 group_idBCR-XL 1 ## 3 patient_idpatient2 0 ## 4 patient_idpatient3 0 ## 5 patient_idpatient4 0 ## 6 patient_idpatient5 0 ## 7 patient_idpatient7 0 ## 9 patient_idpatient8 0

4.7微分测试

上面的步骤展示了如何加载数据、设置元数据、设置设计矩阵和设置对比矩阵。现在，我们可以开始计算微分测试了。

有几个可选选项可用于运行diffcyt微分测试函数。哪一种方法最方便取决于您正在运行的分析类型或管道。选项有:

• 选项1:使用从加载的输入数据运行包装器函数.fcs文件。输入数据可以作为flowSet，或者列表的flowFrames，DataFrames,或data.frames。

• 选项2:使用先前创建的运行包装器函数催化剂daFrame对象。

• 选项3:为管道运行单个函数。

控件演示这些选项Bodenmiller_BCR_XL上面描述的示例数据集。

#注意:使用默认方法'diffcyt-DA- edger '和默认参数#注意:包含可重复聚类的随机种子out_DA <- diffcyt(d_input = d_flowSet, experiment_info = experiment_info, marker_info = marker_info, design = design, contrast = contrast, analysis_type = "DA"， seed_clustering = 123)

##准备数据…

##转换数据…

##生成集群…

## FlowSOM集群在8.9秒内完成

##计算特性…

使用“diffcyt-DA-edgeR”方法计算DA测试…

topTable(out_DA, format_vals = TRUE)

## DataFrame包含20行和3列## cluster_id p_val p_adj ##    ## 97 97 1.92e-51 1.92e-49 ## 33 6.18e-41 3.09e-39 ## 8 8 7.72e-36 2.57e-34 ## 43 43 2.23e-34 5.58e-33 ## 9 9 2.41e-32 4.82e-31 ## ... ... ... ...1.36e-21 8.50e-21 7.04e-21 4.14e-20 ## 73 73 1.28e-20 7.09e-20 ## 31 31 7.02e-19 3.69e-18 ## 89 89 3.60e-18 1.80e-17

#计算错误发现率(FDR)阈值<- 0.1 res_DA_all <- topTable(out_DA, all = TRUE)表(res_DA_all$p_adj <= threshold)

## ##假的真## 24 76

#注意:使用默认方法'diffcyt-DS-limma'和默认参数#注意:包含可重复集群的随机种子out_DS <- diffcyt(d_input = d_flowSet, experiment_info = experiment_info, marker_info = marker_info, design = design, contrast = contrast, analysis_type = "DS"， seed_clustering = 123, plot = FALSE)

##准备数据…

##转换数据…

##生成集群…

## FlowSOM集群在9.3秒内完成

##计算特性…

##使用方法'diffcyt-DS-limma'计算DS测试…

警告:14个探针的部分NA系数

topTable(out_DS, format_vals = TRUE)

## DataFrame, 20行4列## cluster_id marker_id p_val p_adj ##     ## 30 30 pS6 1.18e-11 1.65e-08 ## 19 19 pS6 1.10e-10 7.69e-08 ## 19 19 pPlcg2 7.22e-10 3.03e-07 ## 10 10 pS6 1.08e-09 3.03e-07 ## 20 20 pS6 1.01e-09 3.03e-07 ## ... ... ... ... ...## 19 19 pAkt 5.66e-07 4.95e-05 ## 39 39 pNFkB 6.37e-07 4.96e-05 ## 45 45 pBtk 6.35e-07 4.96e-05 ## 19 19 pZap70 9.49e-07 5.81e-05 ## 4 4 pBtk 9.13e-07 5.81e-05

#计算# 10%错误发现率(FDR)阈值<- 0.1时显著检测到的DS集群标记组合的数量res_DS_all <- topTable(out_DS, all = TRUE)表(res_DS_all$p_adj <= threshold)

## ## false true ## 570 830

#准备数据d_se <- prepareData(d_flowSet, experiment_info, marker_info)

# Transform data d_se <- transformData(d_se)

注意:为可复制的集群添加随机种子d_se <- generatecluster (d_se, seed_cluster = 123)

## FlowSOM集群在9.7秒内完成

#计算集群细胞计数d_counts <- calcCounts(d_se) #计算集群中位数d_medians <- calcMedians(d_se)

res_DA <- testDA_edgeR(d_counts, design, contrast) #显示顶级DA集群的结果表topTable(res_DA, format_vals = TRUE)

## DataFrame包含20行和3列## cluster_id p_val p_adj ##    ## 97 97 1.92e-51 1.92e-49 ## 33 6.18e-41 3.09e-39 ## 8 8 7.72e-36 2.57e-34 ## 43 43 2.23e-34 5.58e-33 ## 9 9 2.41e-32 4.82e-31 ## ... ... ... ...1.36e-21 8.50e-21 7.04e-21 4.14e-20 ## 73 73 1.28e-20 7.09e-20 ## 31 31 7.02e-19 3.69e-18 ## 89 89 3.60e-18 1.80e-17

#计算在10%错误发现时检测到的显著数据集群的数量#率(FDR)阈值<- 0.1表(topTable(res_DA, all = TRUE)$p_adj <= threshold)

## ##假的真## 24 76

testDS_limma(d_counts, d_medians, design, contrast, plot = FALSE)

警告:14个探针的部分NA系数

topTable(res_DS, format_vals = TRUE)

## DataFrame, 20行4列## cluster_id marker_id p_val p_adj ##     ## 30 30 pS6 1.18e-11 1.65e-08 ## 19 19 pS6 1.10e-10 7.69e-08 ## 19 19 pPlcg2 7.22e-10 3.03e-07 ## 10 10 pS6 1.08e-09 3.03e-07 ## 20 20 pS6 1.01e-09 3.03e-07 ## ... ... ... ... ...## 19 19 pAkt 5.66e-07 4.95e-05 ## 39 39 pNFkB 6.37e-07 4.96e-05 ## 45 45 pBtk 6.35e-07 4.96e-05 ## 19 19 pZap70 9.49e-07 5.81e-05 ## 4 4 pBtk 9.13e-07 5.81e-05

#计算# 10%错误发现率(FDR)阈值<- 0.1时显著检测到的DS集群标记组合的数量表(topTable(res_DS, all = TRUE)$p_adj <= threshold)

## ## false true ## 570 830

6.1概述

如本文所述，介绍了diffcyt框架(Weber等人，2019)， a的结果diffcyt差异分析以调整p值的形式提供给用户，允许识别检测到的显著集群(用于DA测试)或集群标记组合(用于DS测试)。然后可以使用可视化来解释检测到的群集或群集标记组合;例如，解释标记表达谱，以便将检测到的集群与已知的细胞群体相匹配，或者将高分辨率集群分组到具有一致表型的较大细胞群体中。

广泛的绘图功能，以产生探索性可视化和可视化的结果，从差分测试催化剂软件包(Chevrier, Crowell, Zanotelli等人，2018)。这些绘图函数在我们的CyTOF工作流(Nowicka et al.， 2019)可从Bioconductor获得。有关更多详细信息，包括可视化的进一步示例，请参阅CyTOF工作流或者是催化剂Bioconductor装饰图案。(热图是使用ComplexHeatmapBioconductor包;Gu et al.， 2016。)

在这里，我们生成热图来说明上面执行的差异分析的结果。请注意催化剂绘图函数可以接受diffcyt结果对象SummarizedExperiment格式(从上面的选项1和3)或催化剂daFrame格式(选项2)。

6.2热图:DA测试结果

这张热图说明了从DA测试中检测到的顶级(最显著的)集群的表型(标记表达谱)和感兴趣的信号(样本的集群丰度)。

行表示聚类，列表示蛋白质标记(左图)或样本(右图)。左面板显示了所有样本中细胞类型标记(即集群表型)的中位数(arcsinh转化)表达值。右面板显示感兴趣的信号:按样本的群集丰度(用于DA测试)。右边的注释条表示在调整后的p值阈值为10%时检测到显著差异的聚类。

如前所述，DA测试对于Bodenmiller_BCR_XL因为该数据集中感兴趣的主要信号是pS6和其他信号标记在B细胞和其他几种细胞群体中的差异表达。但是，为了便于说明，我们在这里包含了图表，以展示如何使用这些函数。

(注意:对于下面的例子，我们使用的是早期版本的热图绘制函数diffcyt包装，而不是使用催化剂。这样做是为了减少依赖关系，以便简化安装和编译diffcyt包装和小品。生成热图的替代代码催化剂也显示;这个版本包含额外的格式，通常是首选的。)

看到plotDiffHeatmap ?（催化剂)或plotHeatmap ?（diffcyt)查阅详情。

注意:使用可选参数'sample_order'来对样本进行分组，条件sample_order <- c(seq(2,16, by = 2)， seq(1,16, by = 2)) plotHeatmap(out_DA, analyis_type = "DA"， sample_order = sample_order)

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *

6.3热图:DS测试结果

这张热图说明了从DS测试中检测到的最高(最显著)集群标记组合的表型(标记表达谱)和感兴趣的信号(样本中细胞状态标记的中位数表达)。

行表示聚类标记组合，列表示蛋白质标记(左图)或样本(右图)。左面板显示了所有样本中细胞类型标记(即集群表型)的中位数(arcsinh转化)表达值。右面板显示感兴趣的信号:样本中细胞状态标记的中位数表达(用于DS测试)。右边的注释条表示在调整后的p值阈值为10%时检测到显著差异的聚类标记组合。

热图显示diffcytPipeline已经成功地恢复了该数据集中感兴趣的主要差分信号。如上所述，Bodenmiller_BCR_XL数据集包含已知的几种信号标记(细胞状态标记)在几种细胞群体中的强差异表达。其中，pS6在B细胞中的差异表达信号最强。

正如预期的那样，检测到的几个最高(最显著)的簇标记组合代表了B细胞中pS6(右侧注释栏中的标签)的差异表达(通过CD20的高表达来识别，左图)。同样，热图中显示的其他顶部检测到的聚类标记组合对应于该数据集中其他已知的强差分信号(见Nowicka et al.， 2017，图29;或者对数据集结果的描述BCR-XL在本文中，我们介绍了diffcyt框架(Weber等人，2019)。

(注意:对于下面的例子，我们使用的是早期版本的热图绘制函数diffcyt包装，而不是使用催化剂。这样做是为了减少依赖关系，以便简化安装和编译diffcyt包装和小品。生成热图的替代代码催化剂也显示;这个版本包含额外的格式，通常是首选的。)

看到plotDiffHeatmap ?（催化剂)或plotHeatmap ?（diffcyt)查阅详情。

注意:使用可选参数'sample_order'根据条件sample_order <- c(seq(2,16, by = 2)， seq(1,16, by = 2))对样本进行分组plotHeatmap(out_DS, analyis_type = "DS"， sample_order = sample_order)

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