用proActiv从RNA-Seq数据中识别活性和替代启动子

总结

大多数人类基因有多个启动子，控制不同亚型的表达。使用这些替代启动子可以在转录前调节异构体的表达。替代启动子已被发现在广泛的细胞类型和疾病中是重要的。

proActiv是一种从RNA-Seq数据中分析启动子的方法。proActiv使用对齐的读取作为输入，然后为每个注释启动子生成计数和标准化启动子活性估计值。然后，这些估计可以用来确定哪些启动子是活跃的，哪些启动子是不活跃的，以及哪些启动子在不同条件下会改变其活性。

在这里，我们提供了使用proActiv的快速入门指南，以及在两种条件下识别活性启动子和替代启动子的详细工作流程。

如果您在研究中使用proActiv，请注明:

demirciozylu, Deniz等，“泛癌症转录组分析揭示了通过替代启动子的普遍调控。”细胞178.6(2019): 1465-1477。

内容

• 快速入门:用proActiv量化启动子活性
• 一个完整的工作流程，以确定替代启动子的使用
  • 准备输入数据
  • 启动子注释的制备
  • 高伦雅芙运行
  • 识别替代启动子
• 分析和可视化替代启动子的使用
  • 替代启动子的使用
  • 启动子类别比例
  • 按职位划分的主要/次要促销员
  • 主启动子活性与基因表达
  • t-SNE
• 得到帮助
• 高伦雅芙为由
• 会话信息

快速入门:用proActiv量化启动子活性

proActiv通过RNA-Seq数据估计启动子活性。启动子活性定义为每个启动子启动的转录总量。proActiv将BAM文件或连接文件(TopHat2或STAR)和相关基因组的启动子注释对象作为输入。可选参数条件可以提供，描述与每个输入文件对应的条件。在这里，我们演示了proActiv与STAR连接文件(人类基因组GRCh38 Gencode v34)作为输入。由于大小限制，分析仅限于chr1的子集(10,000,000-30,000,000)。

图书馆(高伦雅芙)作为输入的STAR连接文件列表文件< -list.files（执行（“extdata /装饰图案/连接”，包=“高伦雅芙”)，full.names =真正的）描述实验条件的向量条件< -代表（c（“A549”，HepG2的)，每一个=3.）人类基因组GENCODE v34的启动子注释仅限于chr1的子集promoterAnnotation < -promoterAnnotation.gencode.v34.subset结果< -高伦雅芙（文件=文件,promoterAnnotation =promoterAnnotation,条件=条件)

结果是一个summarizeexperiment对象，可以通过如下方式访问:

• 化验(结果)返回原始/归一化启动子计数，绝对/相对启动子活性和基因表达
• rowData(结果)按条件返回启动子元数据和汇总的绝对启动子活性和基因表达

一个完整的工作流程，以确定替代启动子的使用

在这里，我们提供了一个完整的分步工作流程，用于使用proActiv分析启动子活性，并在不同条件下的样本中识别替代启动子的使用。我们将比较来自2个不同细胞系(A549和HepG2)的样本，以确定替代启动子。

文件< -list.files（执行（“extdata /装饰图案/连接”，包=“高伦雅芙”)，full.names =真正的）

##从GTF文件路径gtf。文件< -执行（“extdata /装饰图案/注释/ gencode.v34.annotation.subset.gtf.gz”，包=“高伦雅芙”）promoterAnnotation.gencode.v34.subset<-preparePromoterAnnotation（文件=gtf.file,物种=“Homo_sapiens”）##从TxDb对象txdb。文件< -执行（“extdata /装饰图案/注释/ gencode.v34.annotation.subset.sqlite”，包=“高伦雅芙”）txdb < -loadDb(txdb.file)promoterAnnotation.gencode.v34.subset<-preparePromoterAnnotation（txdb =txdb,物种=“Homo_sapiens”）

的名字(GenomeInfoDb：：genomeStyles（））#>[1]“拟南芥_thaliana”“秀丽隐杆线虫”#>[3]“Canis_familiaris”“Cyanidioschyzon_merolae”"Drosophila_melanogaster" "Homo_sapiens"#>[7]“Mus_musculus”“Oryza_sativa”#>[9]“胡杨/赤毛霉”“褐家鼠”#>[11]“Saccharomyces_cerevisiae”“Zea_mays”

promoterAnnotation < -promoterAnnotation.gencode.v34.subset条件< -代表（c（“A549”，HepG2的)，每一个=3.）结果< -高伦雅芙（文件=文件,promoterAnnotation =promoterAnnotation,条件=条件)

显示(结果)#>类:总结实验#> dim: 1380# >元数据(0):#> assays(5): promoterCounts normalizedPromoterCounts#> absolutePromoterActivity relativePromoterActivity基因表达#> rownames(1380): 1 2…1379 1380#> rowData names(14): promoterId geneId…A549.class HepG2.class#> colnames(6): sgnex_a549_illumina_replicate1 .run1.子集. sj .out# SGNEx_A549_Illumina_replicate3.run1.subset.SJ.out…# > SGNEx_HepG2_Illumina_replicate4.run1.subset.SJ.out# > SGNEx_HepG2_Illumina_replicate5.run1.subset.SJ.out#> colData names(2): sampleName条件

通过消除NA启动子计数来去除单外显子转录本/启动子结果< -结果(complete.cases（化验(结果)＄promoterCounts),)

alternativePromoters < -getAlternativePromoters（结果=结果,referenceCondition =“A549”）将绝对启动子活性与条件相匹配…拟合相对启动子活性的条件…显示(alternativePromoters)# > upReg美元#> promoterId geneId padjAbs padjRel#> 137 137 ensg00000076864.19 0.004137450 0.03624923#> 138 138 ensg00000076864.19 0.009286492 0.03364840#> 314 314 ensg00000117632.23 0.002433754 0.02968373# ># > downReg美元#> promoterId geneId padjAbs padjRel#> 141 141 ensg00000076864.19 0.007574438 0.0336484

分析和可视化替代启动子的使用

在这里，我们提供了上述工作流返回的数据的几种可视化。

情节< -boxplotPromoters(因此,“ENSG00000076864.19”）绝对启动子活动的箱线图图书馆(gridExtra)grid.arrange(情节[[1]],情节[[3.]],nrow =1，ncol =2，宽度=c（3.，2）)

图书馆(ggplot2)rdata < -rowData(结果)创建一个总结细胞系和启动子类的长数据框架pdata1 < -data.frame（cellLine =代表（c（“A549”，HepG2的)，每一个=nrow(rdata)),promoterClass =as.factor（c(rdata＄A549.class, rdata＄HepG2.class)))ggplot（na.omit(pdata1))+geom_bar（aes（x =cellLine,填补=promoterClass))+xlab（细胞株的）+ylab（“数”）+实验室（填补=“子类别”）+ggtitle（“推动者的分类”）

因为很多基因都有很多注释启动子，所以我们会折叠启动子##从第5个位置开始，为了简单起见进入一组pdata2 < -as_tibble(rdata)% > %变异（promoterPosition =ifelse(promoterPosition>5，5, promoterPosition))% > %过滤器(HepG2.class%, %c（“主要的”，“小”）)ggplot(pdata2)+geom_bar（aes（x =promoterPosition,填补=as.factor(HepG2.class)),位置=“填满”）+xlab（表达式(启动子～位置～“5”% - > %“3”）)+ylab（“比例”）+实验室（填补=“子类别”）+ggtitle（“HepG2中主要/次要启动子比例”）+scale_y_continuous（打破了=seq（0，1，０．２５)，标签=paste0（seq（0，One hundred.，25)，“%”）)+scale_x_continuous（打破了=seq（1，5)，标签=c（' 1 '，' 2 '，“3”，“4”，“> = 5”）)

获得HepG2的活跃主启动子majorPromoter < -as_tibble(rdata)% > %group_by(geneId)% > %变异（promoterCount =n（））% > %过滤器(HepG2.class= =“主要的”）pdata3 < -data.frame（高伦雅芙=majorPromoter＄HepG2.mean,geneExp =majorPromoter＄HepG2.gene.mean,promoterCount =majorPromoter＄promoterCount)ggplot(pdata3aes（x =geneExp,y =高伦雅芙))+geom_point（aes（颜色=promoterCount),α=0．5）+ggtitle（“HepG2中的主启动子活性与基因表达”）+xlab（“平均基因表达”）+ylab（“平均主启动器活动”）+实验室（颜色=的数量\ n带注释的启动子的）+geom_abline（斜率=1，拦截=0，颜色=“红色”，线型=“冲”）

图书馆(Rtsne)##删除不活跃的启动子(稀疏行)数据< -化验(结果)＄absolutePromoterActivity% > %过滤器（rowSums(.)>0）数据< -data.frame（t(数据)数据＄示例< -as.factor(条件)set.seed（40）可重复性#tsne.out<-Rtsne（as.matrix（子集(数据、选择=-c(样本))),困惑=1）情节（x =tsne.out＄Y (,1]，y =tsne.out＄Y (,2]，bg =数据＄样本,asp =1，坳=“黑”，pch =24，cex =4，主要=t-SNE阴谋与推动者\ n至少在一个样本中活跃，xlab =“T-SNE1”，ylab =“T-SNE2”，xlim =c（-300，300)，ylim =c（-300，300）)传说（“topright”，插图=02，title =细胞株的，独特的(条件),pch =c（24，24)，pt.bg =1：长度（独特的(条件)),cex =1．5，电池=“n”）

得到帮助

您可以在Bioconductor支持站点提出疑问和问题:https://support.bioconductor.org．确保你的帖子带有标签高伦雅芙．

或者，可以在proActiv Github存储库中提出问题:https://github.com/GoekeLab/proActiv．

高伦雅芙为由

如果您使用proActiv，请注明:

demirciozylu, Deniz等，“泛癌症转录组分析揭示了通过替代启动子的普遍调控。”细胞178.6(2019): 1465-1477。

会话信息

#> R版本4.2.1(2022-06-23)#>平台:x86_64-pc-linux-gnu(64位)#>运行在:Ubuntu 20.04.5 LTS #> #>矩阵产品:默认#> BLAS: /home/biocbuild/bbs-3.16-bioc/R/lib/libRblas。所以#> LAPACK: /home/biocbuild/bbs-3.16-bio /R/lib/libRlapack。so #> #> locale: #> [1] LC_CTYPE=en_US。UTF-8 LC_NUMERIC= c# > [3] LC_TIME=en_GB LC_COLLATE= c# > [5] LC_MONETARY=en_US。utf - 8 LC_MESSAGES = en_US。UTF-8 #> [7] LC_PAPER=en_US。UTF-8 LC_NAME= c# > [9] LC_ADDRESS=C LC_TELEPHONE= c# > [11] LC_MEASUREMENT=en_US。UTF-8 LC_IDENTIFICATION= c# b> # b>附加基础包:#> [1]stats graphics grDevices utils datasets methods base #> #>其他附加包:#> [1]Rtsne_0.16 ggplot2_3.3.6 gridExtra_2.3 proActiv_1.8.0 #> #>通过命名空间加载(且未附加):# > [1] bitops_1.0-7 matrixStats_0.62.0 # > [3] bit64_4.0.5 filelock_1.0.2 # > [5] RColorBrewer_1.1-3 progress_1.2.2 # > [7] httr_1.4.4 GenomeInfoDb_1.34.0 # > [9] tools_4.2.1 bslib_0.4.0 # > [11] utf8_1.2.2 R6_2.5.1 # > [13] KernSmooth_2.23-20 DBI_1.1.3 # > [15] BiocGenerics_0.44.0 colorspace_2.0-3 # > [17] withr_2.5.0 tidyselect_1.2.0 # > [19] prettyunits_1.1.1 DESeq2_1.38.0 # > [21] bit_4.0.4 curl_4.3.3 # > [23] compiler_4.2.1 cli_3.4.1 # > [25] Biobase_2.58.0 xml2_1.3.3 # > [27] DelayedArray_0.24.0labeling_0.4.2 # > [29] rtracklayer_1.58.0 sass_0.4.2 # > [31] caTools_1.18.2 scales_1.2.1 # > [33] genefilter_1.80.0 rappdirs_0.3.3 # > [35] stringr_1.4.1 digest_0.6.30 # > [37] Rsamtools_2.14.0 rmarkdown_2.17 # > [39] XVector_0.38.0 pkgconfig_2.0.3 # > [41] htmltools_0.5.3 MatrixGenerics_1.10.0 # > [43] highr_0.9 dbplyr_2.2.1 # > [45] fastmap_1.1.0 rlang_1.0.6 # > [47] RSQLite_2.2.18 farver_2.1.1 # > [49] BiocIO_1.8.0 jquerylib_0.1.4 # > [51] generics_0.1.3 jsonlite_1.8.3 # > [53] gtools_3.9.3BiocParallel_1.32.0 # > [55] dplyr_1.0.10 rcurl_1.98 - 1.9 # > [57] magrittr_2.0.3 GenomeInfoDbData_1.2.9 # > [59] Matrix_1.5-1 Rcpp_1.0.9 # > [61] munsell_0.5.0 S4Vectors_0.36.0 # > [63] fansi_1.0.3 lifecycle_1.0.3 # > [65] stringi_1.7.8 yaml_2.3.6 # > [67] SummarizedExperiment_1.28.0 zlibbioc_1.44.0 # > [69] gplots_3.1.3 BiocFileCache_2.6.0 # > [71] grid_4.2.1 blob_1.2.3 # > [73] parallel_4.2.1 crayon_1.5.2 # > [75] lattice_0.20-45 Biostrings_2.66.0 # > [77] splines_4.2.1 GenomicFeatures_1.50.0 # > [79]annotate_1.76.0 hms_1.1.2 #> [81] KEGGREST_1.38.0 locfit_1.5-9.6 #> [83] knitr_1.40 pillar_1.8.1 #> [87] geneplotter_1.76.0 codetools_0.2-18 #> [89] biomaRt_2.54.0 stats4_4.2.1 #> [91] XML_3.99-0.12 glue_1.6.2 #> [93] evaluate_0.17 data.table_1.14.4 #> [95] png_0.1-7 vctrs_0.5.0 #> [97] gtable_0.3.1 assertthat_0.2.1 #> [101] xtable_1. 4 restfulr_0.0.15 #>[103]幸存者3.4-0 tibble_3.1.8 #> [105] GenomicAlignments_1.34.0AnnotationDbi_1.60.0 #> [107] memoise_2.0.1 IRanges_2.32.0 #> [109] ellipsis_0.3.2