3.1一个排列测试是如何工作的呢?

有三个主要元素需要执行一个排列测试:我们的RS、随机化策略和一个评价函数。让我们看看它是如何运作的一个例子:

想象我们获得一组基因,我的特殊基因,我们想给他们往往在于基因组的某些部分,在我们的案例中一系列的地区我们知道改变,例如,他们拷贝数增加。

首先我们需要我们的RSs加载到r .我们可以使用toGRanges函数。

特殊的< - toGRanges(系统。文件(“extdata”、“my.special.genes。txt”,包= "地区"))。< - toGRanges(系统的基因。文件(“extdata”、“all.genes。txt”,包= "地区"))< - toGRanges(系统改变。文件(“extdata”、“my.altered.regions。txt”,包= "地区"))长度(特殊)

# # 200年[1]

长度(all.genes)

# # 49646年[1]

长度(改变)

# # 8 [1]

接下来我们需要的是一个评估函数。在我们的示例中我们想要测试的重叠RS与改变的区域,所以我们将使用numOverlaps函数,给定两个RS返回它们之间重叠的数量。

使用numOverlaps我们可以数一数之间的重叠两个RS,在我们的案例中我们可以计算数量的特殊基因重叠区域的改变。

numOverlaps(特别的,改变)

# # 114年[1]

但这个数字,114年的200年,大还是小?这是否意味着相关基因改变地区吗?或者可能只是偶然?

这里是随机化策略发挥其作用的地方。我们需要一个随机化策略,创建一个新的地区,是随机的对我们的评估函数,而是考虑原来的区域设置的特异性。例如,如果我们的原始RS来自上天的一个实验中,所有的地区都可映射的部分基因组中并没有任何意义随机区域变成一个着丝点或任何其他non-mappable基因组的一部分。

所提供的帮助,许多随机化功能地区接受一个面具,表明随机区域不能被放置的地方。在任何情况下,选择最佳的随机化策略是一个关键部分的排列测试和最终结果有很大的影响。

最不受限制的函数中地区是randomizeRegions,给定一个RS,基因组和一个可选的面具,返回一个新的RS与相同数量的地区和相同的宽度与原始的随机放置在non-masked部分基因组。这也是最慢的随机函数可用。

在我们的示例中,由于特殊的基因大集合的一个子集的基因更好的使用resampleRegions给定一个宇宙的区域,随机选择一个子集创建随机区组。

随机的。RS < - resampleRegions random.RS(特别的,宇宙= all.genes)

与200范围和2 # #农庄对象元数据列:# # seqnames范围链| V4 V6 # # < Rle > < IRanges > < Rle > | <人物> <人物> # # 31045 chr11 124824016 - 124911385 * | NM_025004 + # # 42604 chr17 80400462 - 80408707 * | NR_036517 - # # 41317 chr17 36337710 - 36348609 * | NM_001291465 - # # 29800 chr11 58390145 - 58393205 * | NM_000614 + # # 33392 chr12 112842993 - 112847443 * | NM_000970 - # #…………………# # 48795 chr22 46756730 - 46933067 * | NM_014246 - # # 6255 chr2 38813 - 46588 * | NM_001077710 - # # 46506 chr20 9288446 - 9461462 * | NM_000933 + # # 14311 chr5 138855112 - 138862375 * | NM_198282 - # # 43175 chr18 47015604 - 47015694 * | NR_003701——# # - - - - - - - # # seqinfo: 24从一个未指明的基因组序列;没有seqlengths

现在,我们可以使用评价函数来测试水平的随机RS协会改变地区。我们可以重复,得到不同的评价。

随机的。RS < - resampleRegions(特别的,宇宙= all.genes) numOverlaps(随机的。RS,改变)

49 # # [1]

随机的。RS < - resampleRegions(特别的,宇宙= all.genes) numOverlaps(随机的。RS,改变)

# # 44 [1]

随机的。RS < - resampleRegions(特别的,宇宙= all.genes) numOverlaps(随机的。RS,改变)

# # [1]54

随机的。RS < - resampleRegions(特别的,宇宙= all.genes) numOverlaps(随机的。RS,改变)

# # 41 [1]

如果我们这样做,很多时候我们会建立一个分布的评价从随机获得RS所以,我们可以把我们的初步评估与那些获得随机和确定合理的原来的评价是否得到机会。实际上,仅仅计算评价的次数随机RS(或降低)高于原来的评估,我们可以计算偶然看到我们最初的评估的概率,这价值正是排列的假定值测试。此外,我们计算的z分数评价的原始RS和之间的距离的均值随机评估除以标准差的随机评估。z分数,虽然没有直接的可比性,可以帮助评估“强度”的评价。

3.2如何执行一个排列测试地区

执行一个排列的主要功能测试地区是permTest,一个函数在一个地区(RS)在接受任何格式(见第四节-地区集),一个随机函数和一个评价函数和返回permTestResults对象。

上述函数执行整个排列测试分析,评估原始RS,创建一个数量的随机化和评估和基因表达计算假定值和z分数。它利用平行包随机并行和评估。

除了3必需的参数,permTest接受其他固定参数-ntimes指定数量的随机化,详细的切换的一个进度条,force.parallel强迫或禁止使用多核运行分析…,它还接受任何额外的参数随机化所需的函数(通常是一个基因组和面具)或评价函数。

例如检查是否我区域重叠重复超过预期,我们可以使用:

#不运行pt < - permTest(=我。地区,B =重复,随机。函数= randomizeRegions evaluate.function = numOverlaps)

或者如果我们想检查我的特殊基因高甲基化水平,我们可以使用一个测试是这样的:

#不运行pt < - permTest(=我。基因,随机。函数= resampleRegions宇宙=。基因,评估。函数= meanInRegions x = methylation.levels.450K)

后我们的示例之前,我的特殊基因,改变区域我们可以叫permTest是这样的:

pt < - permTest(=特殊ntimes = 50,随机。函数= resampleRegions宇宙=。基因,评估。函数= numOverlaps, B =改变,verbose = FALSE)

# #[1]“注:最低假定值只有50排列是0.0196078431372549。你应该考虑增加的数量排列。”

注意:自permTest使用运营商的省略号(…)评估所需的额外的参数和随机函数强烈建议总是使用命名参数(例如= RS1而不是只有RS1)。未能这样做可能导致难以调试错误。

在任何情况下我们会得到一个permTestResults对象与结果分析。查看这个结果我们可以打印或使用总结。在这种情况下,我们可以看到,该协会是统计学意义,所以我们可以得出结论,与我相关的特殊基因改变的区域。

pt

# # $ numOverlaps # #假定值:0.0196078431372549 # # z分数:9.8819 # #的迭代次数:50 # #选择:大# #评估的原始地区集:114 # #评价函数:numOverlaps随机化功能:# # # # # # resampleRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

总结(pt)

# #排列测试:1 # #重要排列测试:1 # #迭代:50 # #随机化功能:resampleRegions # #测试结果:# # pvalue zscore测试# # numOverlaps 0.01960784 - 9.8819大

我们可以得到一个图形表示的结果排列测试使用情节。它描绘了一个灰色的直方图表示的评价随机RS安装正常,黑条代表的均值随机评估和绿色栏代表的评价原始RS。此外,红条(和红色阴影)代表意义限制(默认0.05)。因此,如果绿色的酒吧是在红色阴影区域这意味着最初的评估极不可能因此假定值将是巨大的。

情节(pt)

比较,想象我们有一个第二子集的基因,我定期基因,不与改变相关的区域。我们可以运行相同的测试,我们将得到一个负面的结果。在这种情况下,我们得到一个非重要假定值和图中我们可以看到原始的评估是接近的意思是随机的。

常规< - toGRanges(系统。文件(“extdata”、“my.regular.genes。txt”,包= "地区"))长度(常规)

# # 200年[1]

numOverlaps(常规,改变)

# # 46 [1]

pt.reg < permTest(有规律的、ntimes = = 50,随机。函数= resampleRegions宇宙=。基因,评估。函数= numOverlaps, B =改变,verbose = FALSE)

# #[1]“注:最低假定值只有50排列是0.0196078431372549。你应该考虑增加的数量排列。”

pt.reg

# # $ numOverlaps # #假定值:0.254901960784314 # # z分数:-0.5547 # #的迭代次数:50 # #选择:少# #评价的原始地区设置:46 # #评价功能:numOverlaps随机化功能:# # # # # # resampleRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

情节(pt.reg)

3.3报告的数量排列

选择正确的数量的排列并不是一个简单的任务。大量的排列会产生更精确的结果,更好的情节,但排列测试可以计算昂贵,根据地区的数量RS和随机化策略选择它可能需要几个小时执行一个排列测试几千排列。另一方面,最低的假定值是有限的数量排列和执行与低排列排列测试号码可以产生不准确的结果。一个好的策略可以尝试第一次的排列和继续只有结果看好或者至少不清楚,因为如果在一些排列的原始评价非常接近随机化的均值,它最终将重要的概率很小。较低的排列,地区将生成一个注明最低的假定值实现和晚增加排列号码。

作为一个例子,上面的两个排列的测试中,如果运行5000排列会产生这样的情节。

#没有运行-见图1 pt.5000 < permTest (ntimes = 5000 =特殊,随机。函数= resampleRegions宇宙=。基因,评估。函数= numOverlaps, B =改变,verbose = TRUE)情节(pt.5000)

这是一个重要的情节排列测试5000排列。

#没有运行-见图2 pt.5000。reg < - permTest(=定期ntimes = 5000,随机。函数= resampleRegions宇宙=。基因,评估。函数= numOverlaps, B =改变,verbose = TRUE)情节(pt.5000.reg)

这是不重要的情节排列测试5000排列。

3.4随机函数

选择一个好的随机化策略在执行一个排列测试是至关重要的。一个人应该选择一个随机化策略,ramdomizes区域对协会的评价,同时保持尽可能多的内在结构和特征区域。例如,一般不会有意义随机区域变成一个着丝点或任何不可用地区这样一个unmappable地区门店数据。

在地区一个随机函数是任何函数,采用RS作为参数,并返回一个RS与随机区域。不同的随机函数包含在包,但是也可以创建自定义随机函数更具体的需求(见第四部分地区集)。

< - toGRanges (data.frame(对应= c (“chr1”、“chr1”,“chr1”),开始= c(20000、50000、100000),结束= c (22000、70000、400000)))

randomizeRegions(基因组=“hg19”)

与3和0 # #农庄对象元数据列:链# # # # seqnames范围< Rle > < IRanges > < Rle > # # [1] chr5 54829332 - 54829332 * # # [2] chr4 62031963 - 62031963 * # # [3] chrX 3133032 - 3133032 * # # - - - - - - - # # seqinfo: 298年从一个未指明的基因组序列;没有seqlengths

randomizeRegions(基因组=“hg19”, per.chromosome = TRUE)

与3和0 # #农庄对象元数据列:链# # # # seqnames范围< Rle > < IRanges > < Rle > # # [1] chr1 156910316 - 156910316 * # # [2] chr1 221000108 - 221000108 * # # [3] chr1 41402430 - 41402430 * # # - - - - - - - # # seqinfo: 298年从一个未指明的基因组序列;没有seqlengths

circularRandomizeRegions(基因组=“hg19”,面具= NA)

与3和0 # #农庄对象元数据列:链# # # # seqnames范围< Rle > < IRanges > < Rle > # # 1 chr1 146003475 - 146003475 * # # 2 chr1 146033475 - 146033475 * # # 3 chr1 146033475 - 146383475 * # # - - - - - - - # # seqinfo: 1从一个未指明的基因组序列;没有seqlengths

3.5评价函数

评价函数是函数定义是什么排列测试被测试。提供了一些评价函数地区涵盖最常见的使用但它是可能的(简单)来创建您自己的自定义评价函数(参见2.6.1的一节)。一般来说,一个评估函数是一个函数RS和返回一个数值。

3.6自定义函数

可以使用自定义在permTest随机化和评价策略。为此,用户只需要创建一个合适的函数和给它permTest函数作为参数。

gcContent < -函数(bsgenome,…) {< - toGRanges reg。seq < - getSeq (bsgenome) base.frequency < - alphabetFrequency (reg.seqs) gc。pct < -(总和(base.frequency [C]) +总和(base.frequency (“G”])) /笔(宽度(A))返回(gc.pct)}

permuteRegionsMetadata < -函数(…),{< - toGRanges (A) mcols (A) (1) < - mcols (A)(样本(长度(A)), 1]返回(A)}

3.7注意在再现性

为了创建可复制的代码与函数,使用随机数字排列测试等地区,有必要使用set.seed。然而,由于地区使用平行执行测试设置也是必要的mc.set.seed参数错误,以确保再现性。

< - createRandomRegions (nregions = 50,长度。意味着= 5000000,length.sd = 3000000)B < - c ([1:25], createRandomRegions (nregions = 25、长度。意味着= 500000,没有mc.set length.sd = 30000) #。种子= FALSE set.seed (123) overlapPermTest (A, B, ntimes = 10, force.parallel = TRUE)

# #[1]“注:最低假定值只有10排列是0.0909090909090909。你应该考虑增加的数量排列。”

# # $ numOverlaps # #假定值:0.0909090909090909 # # z分数:6.6246 # #的迭代次数:10 # #注:不到20迭代所产生不可靠的结果替代:# # # #大评价的原始地区设置:26 # #评价函数:numOverlaps随机化功能:# # # # # # randomizeRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

set.seed (123) overlapPermTest (A, B, ntimes = 10, force.parallel = TRUE)

# #[1]“注:最低假定值只有10排列是0.0909090909090909。你应该考虑增加的数量排列。”

# # $ numOverlaps # #假定值:0.0909090909090909 # # z分数:13.0084 # #的迭代次数:10 # #注:不到20迭代所产生不可靠的结果替代:# # # #大评价的原始地区设置:26 # #评价函数:numOverlaps随机化功能:# # # # # # randomizeRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

与mc.set #。种子= FALSE set.seed (123) overlapPermTest (A, B, ntimes = 10, mc.set。种子= FALSE, force.parallel = TRUE)

# #[1]“注:最低假定值只有10排列是0.0909090909090909。你应该考虑增加的数量排列。”

# # $ numOverlaps # #假定值:0.0909090909090909 # # z分数:8.7964 # #的迭代次数:10 # #注:不到20迭代所产生不可靠的结果替代:# # # #大评价的原始地区设置:26 # #评价函数:numOverlaps随机化功能:# # # # # # randomizeRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

set.seed (123) overlapPermTest (A, B, ntimes = 10, mc.set。种子= FALSE, force.parallel = TRUE)

# #[1]“注:最低假定值只有10排列是0.0909090909090909。你应该考虑增加的数量排列。”

# # $ numOverlaps # #假定值:0.0909090909090909 # # z分数:8.7964 # #的迭代次数:10 # #注:不到20迭代所产生不可靠的结果替代:# # # #大评价的原始地区设置:26 # #评价函数:numOverlaps随机化功能:# # # # # # randomizeRegions attr(,“类”)# # [1]“permTestResultsList”

6.1基因组

在地区染色体的基因组是一个简单的列表及其长度。因此,可以通过指定一个基因组data.frame2列(空空的和长度)或3列(空空的,开始和结束)或农庄对象与一个地区每个染色体。然而,当使用一个标准的染色体作为可用BSgenome,它是可能的和更方便依赖自动加载的基因组(考虑到系统中安装)。通过指定BSgenome基因组的名称如hg19 mm9, dm2…-地区将获取正确的基因组信息。

6.2面具

与基因组一样,可以指定一个面具data.frame或农庄对象的“禁止”地区。然而,也有可能和更方便使用的自动检索默认掩码BSgenome如果它是适合应用程序。再一次,自动检索面具,掩盖了版本的BSgenome必须安装。

6.3如何检索一个基因组和面具吗

的getGenomeAndMask接受两个参数,一个基因组和一个可选的面具。一般来说,基因组将基因组组装的名字(“hg19”、“mm10”,等等…)和函数将检查是否安装了这个名字的有一个基因组并返回。如果没有可用的时候,会提示用户安装它。如果基因组的蒙面版本可用,这是一个将被使用。如果一个基因组已经可用的形式data.frame或农庄对象(或任何其他有效的RS格式),该函数将返回它农庄。

第二个参数,面具,可以用来指定一个面具或显式地请求来检索一个也没有。特别是,如果面具是空的(这是默认值),它将尝试检索的面具BSGenome包,如果面具NA它将返回一个空的面具,如果面具是接受toGRanges它将返回它的面具。

函数返回一个列表基因组和面具的元素,他们两人农庄对象。

6.4过滤染色体

最新版本的基因组包含许多其他“染色体”代表不同的替代程序集和补丁具体复杂的地区。而这些额外染色体是有用的在某些情况下,在他们干扰分析,所以最好删除它们的基因组。这样做,一般过滤任何子集的染色体,地区包括filterChomosomes函数。它将RS并返回一个过滤的版本只包含地区指定的染色体。使用它需要指定一个RS,有机体和染色体的类型(常染色体,规范化,…)。除了可以指定一个自定义列表保持染色体的名字。

可用依赖于生物体染色体类型,和listChrTypes函数可以用来看看生物和染色体子集是可用的。

人类。基因组< - getGenomeAndMask (“hg19”,面具= NA)美元的人类基因组。规范< - filterChromosomes(人类。基因组生物=“汞”)listChrTypes ()

# #智人(hg):常染色体,规范# #亩肌肉(毫米):常染色体,规范# #牛(bosTau):常染色体,规范# #线虫(ce):常染色体,规范# #鲐鱼类(danRer):规范# #猕猴属mulata (rheMac):常染色体,规范# #鼠形(rn):常染色体,规范# #酿酒酵母(sac):常染色体,规范# #黑腹果蝇(dm):常染色体,规范# #黑猩猩(panTro):常染色体,规范化

人类。常染色体< - filterChromosomes(人类。基因组生物=“汞”,chr.type =人类常染色体)。123 < - filterChromosomes(人类。基因组。空空的=c("chr1", "chr2", "chr3"))

7.1功能操作在一个RS

• extendRegions这个函数需要一个RS和两个整数和延伸(扩大)的地区指定的金额。如果一个基因组,它考虑了染色体长度和不延长染色体的区域限制。它可以采取消极的扩展值缩小区域,而不是扩大。
• joinRegions:这个函数接受一个RS和一个整数,min.dist,连接不到的地区min.dist基地。

7.2功能操作在两个RS

• commonRegions:给定两个这个函数返回一个RS A和B农庄对象和他们的十字路口,他们两人共有的基因组区域。
• mergeRegions:给定两个这个函数返回一个RS A和B农庄对象的基因组区域包含在其中,RS是相当于合并成一个,然后融合重叠区域。
• subtractRegions:给定两个这个函数返回一个RS A和B农庄对象的区域没有出现在B,这是部分重叠的地区- B。
• uniqueRegions:给定两个这个函数返回一个RS A和B农庄对象的基因组区域覆盖的A或B而不是两个。

7.3其他功能:函数不返回农庄对象

• overlapRegions:overlapRegions是一个最强大的和有用的RS管理功能地区。它有一个参数的数量和类型的返回值。全面的描述,参考地区用户指南。

给定两个RS A和B,overlapRegions标识的区域在重叠区域B,过滤器,并返回它们。可以过滤通过地区之间的关系(例如,“该地区必须包含在一个从B”)或重叠的数量(例如“至少10基地”,“至少一半的地区”)。返回值可能是一个完整的表的信息,对每一个重叠,该地区,该地区在B和他们的关系,一个布尔向量表示为每个区域在它是否重叠区域B后,过滤条件或简单有效的数量之间的重叠两个RS。此外,可以指定如果额外的数据列与RS必须保持或可能会被忽略。

例子:考虑到与10个地区两个相同的RS染色体1我们一直使用到目前为止,我们可以得到完整的表与重叠:

重叠。df < - overlapRegions overlaps.df (A, B)

# #杆startA安达startB endB类型# # 1 1 1 10 1 10 # # 2 1 15 20 15 20 # # 3 1 24 30 24 30相等

我们可以过滤重叠,只有那些从包含一个区域一个区域B .此外,得到该地区的基地从B:覆盖的区域

重叠。df < - overlapRegions (A、B类型=“比娜”,get.pctA = TRUE) overlaps.df

# #杆startA安达startB endB类型pct.basesA # # 1 1 1 1 10等于100 # # 2 1 15 20 15 20等于100 # # 3 1 24 30 24 30等于100

或只能得到至少5基地的重叠

重叠。df < - overlapRegions (A, B, min.bases = 5) overlaps.df

# #杆startA安达startB endB类型# # 1 1 1 10 1 10 # # 2 1 15 20 15 20 # # 3 1 24 30 24 30相等

或者布尔向量表示的区域在重叠区域B与5或更多的基地(这是很方便的一个子集RS基于区域重叠另一个RS)

重叠。bool < - overlapRegions (A, B, min.bases = 5, only.boolean = TRUE) overlaps.bool

# # 1 2 3 # #真的真的真的

或区域的重叠区域的数量从B至少5个基地

overlaps.int < - overlapRegions (A, B, min.bases = 5, only.count = TRUE) overlaps.int

# # 3 [1]

8.1示例1:CpG岛和基因启动子。一个基本的例子。

8.1.1相关问题:Cpg岛和推动者?

8.1.1.1简短的问题描述:

基因启动子区域GC富人和有许多深藏于发起人CpG岛。然而,它们之间有显著关联?做CpG岛重叠与启动子不止一个期望的机会吗?

8.1.1.2数据集:

我们将使用吴et al . 2010描述的CpG岛和推动者的UCSC的定义为-2000 + 200个碱基对TSS根据基因组组装hg19。启动子文件可以dowloadedhttp://gattaca.imppc.org/regioner/data/UCSC.promoters.hg19.bed。

#没有运行set.seed (12345) cpgHMM < - toGRanges (“http://www.haowulab.org/software/makeCGI/model-based-cpg-islands-hg19.txt”)启动子< - toGRanges (“http://gattaca.imppc.org/regioner/data/UCSC.promoters.hg19.bed”)

8.1.1.3循序渐进的分析:

测试的想法是随机移动CpG岛沿着它们的基因组,数数有多少重叠子。因为我们想要测试是否两套区域有重叠高于预期,我们不需要一个特殊的随机化策略,我们可以使用方便的功能overlapPermTest,它使用permTest在幕后,但预设一些参数(特别是,它使用numOverlaps作为评价函数和randomizeRegions随机化策略)。

开始,我们将删除非规范的推动者和CpG岛染色体,所以我们局限于标准的基因组的一部分,删除任何他们可能包括冗余。

#没有运行cpgHMM < - filterChromosomes (cpgHMM有机体=“汞”,chr.type =“规范”)启动子< - filterChromosomes(启动子,有机体=“汞”,chr.type =“规范”)

此外,为了加速这个例子中,我们将使用2000的65699的一个子集CpG岛地区集。在整个地区通用设置应该使用,在很多情况下,一个足够大的子集应该给一个想法关于协会。使用整个组是完全可能的,只会慢得多。

以确保我们将计数CpG岛只有一次即使重叠2个或更多的推动者,我们使用参数count.once = TRUE,将自动传递到numOverlaps函数。一般来说,所需的任何参数随机化或评价函数可以在这里将使用相关功能。

#不运行cpgHMM_2K < -示例(cpgHMM, 2000) pt <——overlapPermTest (cpgHMM_2K推动者,ntimes = 1000,基因组=“hg19 count.once = TRUE) pt假定值:0.000999000999000999 z分数:60.5237的迭代次数:1000替代:大评价的原始地区集:614评价函数:numOverlaps随机化功能:randomizeRegions意味着交换美元(pt) 79.087

获得的假定值(> 0.001)向我们展示了一个强大的协会。614 2000 CpG岛重叠至少有一个发起人而平均只有79.087岛屿重叠随机区组的启动子。这些结果可以概括在一个阴谋策划perTestResults。

#没有运行情节(pt)

CpG岛和基因启动子之间的联系

在情节我们可以看到灰色评估随机的分布地区,绿色评价的原始地区设置(在这种情况下,614年CpG岛重叠至少有一个发起人),和红色的意义的限制。高z分数和情节做出明显的极端意义协会测试。

8.1.1.4引用:

吴H, Caffo B,杰夫哈,范伯格美联社,伊RA(2010)重新定义CpG岛使用层次隐马尔可夫模型。生物统计学11 (3):499 - 514。

8.2示例2:分析ChIP-seq峰值。高级用法和当地的z分数。

8.2.1问题:在细胞系Hepg2(人类肝细胞癌),是Rad21 (Cohesin)与CTCF ?和基因启动子?这些关联不同吗?

8.2.1.1简短的问题描述:

CTCF蛋白在真核基因组的结构作用及其与cohesin复杂关系很好了昂& Corces 2014。cohesin复杂由四个亚基,Scc1 (Rad21) Scc3, Smc1 Smc3,形成一个环形结构。Cohesin也相关启动子有或没有CTCF (Ong & Corces 2011)。我们想要测试如果峰决定ChIP-seq实验与Rad21重叠超过预期产生的峰值与CTCF ChIP-seq实验。我们也想要测试,如果Rad21山峰重叠与发起人过半的预期。此外,我们想看看这两个协会是不同的。

8.2.1.2数据集:

Rad21与CTCF ChIP-seq山峰从编码项目(http://www.genome.gov/encode/)。UCSC的峰值文件可以下载和阅读使用toGRanges函数。发起人将示例1中一样,也就是说,在UCSC的TSS -2000 / + 200。

#没有运行set.seed (12345) download.file (“http://hgdownload-test.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeAwgTfbsUniform/wgEncodeAwgTfbsSydhHepg2Rad21IggrabUniPk.narrowPeak.gz”、“Rad21.gz”) download.file (“http://hgdownload-test.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeAwgTfbsUniform/wgEncodeAwgTfbsUwHepg2CtcfUniPk.narrowPeak.gz”、“Ctcf.gz”) HepG2_Rad21 < - toGRanges (gzfile (“Rad21.gz”),头= FALSE) HepG2_Ctcf < - toGRanges (gzfile (“Ctcf.gz”),头= FALSE)启动子< - toGRanges (“http://gattaca.imppc.org/regioner/data/UCSC.promoters.hg19.bed”)

8.2.1.3循序渐进的分析:

我们将开始分析通过移除任何特性在染色体非规范使用filterChromosomes。在这种情况下只有启动子在其它染色体区域。此外,加快分析我们将使用只有一个子集的5000的37233 Rad21山峰。最后的例子有更多信息子集的大小。

#没有运行启动子< - filterChromosomes(启动子、生物=“hg19”) HepG2_Rad21_5K < -样本(HepG2_Rad21, 5000)

测试Rad21之间的关联和CTCF或推动者我们将使用permTest函数。我们想要测试如果该地区集重叠超过预期,因此我们将使用numOverlaps作为评价函数,通过它count.once参数计算中每个区域最多一次。我们将使用随机函数circularRandomizeRegions,因为它是速度比randomizeRegions,将使该地区的内部结构(不会改变相邻区域之间的距离)和我们不测试这样的距离。用这个函数可能不可能,以确保一个完美的排斥蒙面的地区,但在这种情况下我们也能容忍。一般来说,在许多情况下,circularRandomizeRegions是一个合适的替代randomizeRegions的好处是快得多。我们还将设置mc.cores = 4所以4处理器核心和使用mc.set.seed = FALSE确保可再生的效果。这两个参数一般不需要。

重要提示:是非常重要的,通过传入的参数的名称permTest,因为它使用省略号…和可能产生意想不到的错误如果参数是传递没有一个名字。

#不运行pt_Rad21_5k_vs_Ctcf < - permTest (= HepG2_Rad21_5K, B = HepG2_Ctcf ntimes = 1000,随机。函数= circularRandomizeRegions评估。函数= numOverlaps计数。一旦= TRUE,基因组=“hg19 mc.set。种子= FALSE, mc.cores = 4) pt_Rad21_5k_vs_Prom < permTest (A = HepG2_Rad21_5K, B =推动者,ntimes = 1000,随机。函数= circularRandomizeRegions评估。函数= numOverlaps计数。一旦= TRUE,基因组=“hg19 mc.set。种子= FALSE, mc.cores = 4) pt_Rad21_5k_vs_Ctcf pt_Rad21_5k_vs_Prom情节(pt_Rad21_5k_vs_Ctcf,主要=“Rad21_5K vs CTCF”)情节(pt_Rad21_5k_vs_Prom,主要=“Rad21_5K vs推动者”)

协会Rad21峰值与CTCF基因启动子。

我们可以看到,测试都是重要的假定值很低。事实上,他们都尽可能低的假定值这个数的随机化,因为没有一个随机区域设置了评估值高于原始设置。然而,协会与CTCF更极端,实际上CTCF的z分数高约25倍比推动者。它是有意义的,因为大约85%的Rad21山峰重叠与CTCF但只有11%重叠基因启动子。

为了进一步研究协会的性质,我们将使用localZscore函数,将原始地区,看看在z分数的影响。在本例中,我们将开始与1000个基点的窗口和步骤的50个基点。当地的z分数运行分析,我们需要给它原来的区域设置,排列的结果所需的额外的参数测试和评价函数,在这种情况下,B = HepG2_Ctcf和count.once = TRUE。

#没有运行lz_Rad21_vs_Ctcf_1 < - localZScore (= HepG2_Rad21_5K, B = HepG2_Ctcf, pt = pt_Rad21_5k_vs_Ctcf窗口= 1000 = 50步,count.once = TRUE) lz_Rad21_vs_Prom_1 < - localZScore (A = HepG2_Rad21_5K, B =推动者,pt = pt_Rad21_5k_vs_Prom窗口= 1000 = 50步,count.once = TRUE)情节(lz_Rad21_vs_Ctcf_1,主要=“Rad21_5k vs CTCF (1 kbp)”)的阴谋(lz_Rad21_vs_Prom_1,主要=“Rad21_5k vs推动者(1 kbp)”)

当地协会的z分数分析Rad21峰值与CTCF和基因启动子1 kbp窗口。

分析z分数的变化当Rad21地区移动他们的初始位置,我们可以看到一个非常不同的概要文件。与CTCF的协会,一个狭窄的峰值是显而易见的。这意味着,如果原始地区,Rad21山峰是流离失所的300个基点,协会的z分数几乎降到了零。这样的明确的窄峰表明协会山峰的高度依赖于准确的位置,在这种情况下,考虑到有意义的内容已经描述colocalization CTCF Rad21。然而在启动子的情况下,我们可以看到,没有区域移动时的z分数的下降。这表明协会我们看到更多的区域,它不那么严格依赖的确切位置区域。

增加窗口值为10000 bp和200个基点的一步,我们可以看到一个更广泛的z分数的变化,我们可以看到有一滴z分数,但在一个高得多的距离,这表明更广泛的地区或区域协会。

#没有运行lz_Rad21_vs_Ctcf_2 < - localZScore (= HepG2_Rad21_5K, B = HepG2_Ctcf, pt = pt_Rad21_5k_vs_Ctcf窗口= 10000 = 500步,count.once = TRUE) lz_Rad21_vs_Prom_2 < - localZScore (A = HepG2_Rad21_5K, B =推动者,pt = pt_Rad21_5k_vs_Prom窗口= 10000 = 500步,count.once = TRUE)情节(lz_Rad21_vs_Ctcf_2,主要=“Rad21_5k vs CTCF (10 kbp)”)的阴谋(lz_Rad21_vs_Prom_2,主要=“Rad21_5k vs推动者(10 kbp)”)

当地协会的z分数分析Rad21峰值与CTCF和基因启动子10 kbp窗口。

注意:在许多情况下,可以使用的一个子集地区协会第一眼看到在测试之前与整个地区。然而,子集的大小是很重要的。图中有测试的结果Rad21协会与CTCF基因启动子和三个不同的子集大小:200年、5000年和所有Rad21 reagions。很明显,5000年的子集能够检测与检测两组地区,但200年的子集与CTCF很强的协会,但显然未能检测启动子的协会。

的影响大小在协会测试子集。

8.2.1.4引用:

Ong CT, Corces VG。增强功能:洞察组织基因表达的调节。Nat牧师麝猫。2011年4月,12 (4):283 - 93。

Ong CT, Corces VG。CTCF:架构蛋白质缩小基因组拓扑和功能。Nat牧师麝猫。2014年4月,15(4):234 - 46所示。

9.1随机函数

随机化的过程区域在基因组的位置可以是困难和费时。不同的功能可用地区很多不同的复杂性和性能,从最简单和最快resampleRegions,随机选择一个子集的区域从有限宇宙的可能区域提供的用户,最慢、最复杂的randomizeRegions,创造真正随机的区域在基因组中,考虑一个面具的非基因组的选择部分,甚至确保随机区域之间没有重叠。

这里是一个简短的描述,每一个随机化的算法comlexity功能:

• resampleRegions:这是内置的随机函数的最快。它使用样本选择N区域从用户提供的宇宙。它基本上是一个线性算法对区域的数量。
• circularRandomizeRegions:这也是一个快速算法,维护该地区的区域之间的距离设置但染色体随机排列他们的立场。之间有一个权衡速度和部分区域重叠的面具,因为它将染色体随机“旋转”,直到找到一组随机区域有重叠的面具下面的最大允许的。因此,它的成本是线性的地区在该地区设置的部分基因组被面具覆盖+ RS低密度却会迅速增加,如果面具。
• randomizeRegions:这个函数完全随机排列沿着基因组区域。在内部,它有三个不同的算法,快速线性,这地方的基因组区域非常快但不能保证成功的所有地区,线性但慢,这地方的基因组区域考虑成功的面具,保证所有地区是否适合的可用空间,和一个二阶算法,随机的地方可用空间的区域之间没有重叠。最后算法的组合三,与一个很好的行为与稀疏的面具和地区集可以成为慢当基因组被面具覆盖的百分比或地区高,特别慢如果允许随机区域之间没有重叠。

在这两个情节你可以看到所需的时间随机变量大小的地区设置与这些算法在不同的条件下。

随机化时间对区域的数量

随机化时间对掩模密度

10.1Memoisation

地区使用memoise加快基因组和面具检索功能,因为它们可以相当缓慢。因此,第一次调用getGenomeAndMask(即从所有函数接受一个基因组)将有一个额外的延迟近30年代。放下电话,基因组和检索几乎intantaneous面具,因为结果已经被缓存。在一些特殊的情况下,有人可能会想要删除缓存和检索从原始源基因组和面具。为此,我们包括函数emptyCacheRegioneR忘记基因组的缓存版本和面具。